Saiki†Alamat saiki: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Kompleks panen cahya pusat reaksi 1 (RC-LH1) minangka komponen fotosintesis inti saka bakteri fototrofik ungu. Kita ngenalake rong struktur mikroskop krio-elektron saka kompleks RC-LH1 saka Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2,65-Å saka kompleks RC-LH114-W kasusun saka 14 puteran subunit LH1 sing ngubengi RC, sing diganggu dening protein W, dene kompleks tanpa protein-W minangka komposisi RC sing diubengi dening RC. Puteran LH1 16 subunit sing ditutup. Perbandingan struktur kasebut menehi wawasan babagan dinamika kuinon ing kompleks RC-LH1, kalebu owah-owahan konformasi sing durung ditemtokake sadurunge nalika ngiket kuinon ing situs RC QB, uga lokasi situs pengikat kuinon tambahan, sing mbantu ngirim menyang RC. Struktur unik protein W nyegah penutupan puteran LH1, saengga nggawe saluran kanggo nyepetake ijol-ijolan kuinon/kuinolon.
Energi sing diwenehake dening fotosintesis bisa njaga meh kabeh urip ing bumi, lan nduweni potensi gedhe kanggo bioteknologi surya. Nalika ningkatake fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu uga nuduhake macem-macem mode energi lan kemampuan metabolisme. Dheweke bisa ngindhari fotosintesis lan tuwuh minangka bakteri heterotrofik ing peteng, bisa ndandani nitrogen lan karbon dioksida, ngasilake hidrogen, lan ngrusak senyawa aromatik (1-3). Kanggo nyedhiyakake energi kanggo proses kasebut, cahya kudu diowahi kanthi cepet lan efisien dadi energi kimia. Proses iki diwiwiti nalika kompleks antena sing njebak cahya nyerep cahya lan nransfer energi sing kejebak menyang pusat reaksi (RC), saengga miwiti pamisahan muatan (4 - 7). Unit dhasar fotosintesis ing bakteri fototrofik ungu kasusun saka RC tipe 2, sing diubengi dening kompleks panen cahya 1 (LH1), mbentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 dibentuk dening susunan heterodimer αβ sing mlengkung, sing saben-saben ngiket rong molekul klorofil bakteri (BChl) lan siji utawa loro karotenoid (8-12). Antena LH1 sing paling prasaja kasusun saka 16 utawa 17 heterodimer αβ sing ngubengi RC (9-13) ing puteran tertutup, nanging ing kompleks inti liyane, peptida transmembran ngganggu kontinuitas LH1 ing sakubenge, kanthi mangkono ningkatake difusi kuinol/kuinon antarane kompleks RC lan sitokrom bc1 (11, 13-15). Tanduran fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) minangka organisme model sing bisa ngerti transfer energi lan elektron sing ndhukung fotosintesis. Struktur kristal pertama Rps. Model kompleks palustris RC-LH1 yaiku RC, sing diubengi dening 15 puteran LH1 heterodimer, sing diganggu dening protein sing ora dingerteni sing diarani "Protein W" (14). Protein-W banjur diidentifikasi minangka RPA4402, yaiku protein 10,5kDa sing ora dikarakterisasi kanthi telung heliks transmembran (TMH) sing diprediksi (16). Kita ngusulake kanggo ngganti jeneng gen rpa4402 sing ngode protein W dadi pufW supaya konsisten karo nomenklatur sing digunakake kanggo gen sing ngode subunit RC-L, M (pufL, pufM) lan LH1α, β (pufA, pufB). Menariknya, protein-W mung ana ing udakara 10% RC-LH1, sing nuduhake Rps. palustris ngasilake rong kompleks RC-LH1 sing beda. Ing kene, kita nglaporake struktur cryo-EM (cryo-EM) resolusi dhuwur saka rong kompleks inti, siji karo protein W lan 14 heterodimer αβ, liyane tanpa protein W lan loop 16 Heterodimer LH1 sing ditutup. Struktur kita makili owah-owahan langkah ing pangerten kompleks RC-LH1 saka Rps. palustris, amarga kita wis nganalisa populasi homogen saben varian lan duwe resolusi sing cukup kanggo nemtokake saben peptida lan pigmen sing kaiket kanthi jelas lan lipid lan kuinon sing gegandhengan. Perbandingan struktur kasebut nuduhake yen telung protein TMH-W sing durung ditemokake ing kompleks RC-LH1 liyane nganti saiki ngasilake saluran kuinon kanggo nyepetake ijol-ijolan kuinon/kuinolon. Sawetara situs pengikatan lipid lan kuinon sing dilestarikake wis diidentifikasi, lan kita wis mbukak owah-owahan konformasi anyar sawise kombinasi kuinon lan RC, sing bisa uga cocog kanggo fotosistem II (PSII) RC organisme fototrofik oksigen. Temuan kita menehi wawasan anyar babagan kinetika pengikatan lan ijol-ijolan kuinon/kuinolon ing kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Kanggo nggampangake panliten rinci babagan rong kompleks sing ditemokake ing Rps. palustris, kita ngisolasi saben RC-LH1 kanthi metode biokimia. Kompleks sing kekurangan protein W (sabanjure diarani ΔpufW) dimurnèkaké saka galur sing ora duwé gen pufW (16), lan mung siji kompleks RC-LH1 sing bisa diasilaké. Kompleks sing ngandhut protein W diasilaké déning galur. Protein W saka galur iki dimodifikasi nganggo tag 10x His ing C-terminus, saéngga kompleks sing ngandhut protein W bisa digabungaké kanthi efektif karo umumé protein W sing kurang kanthi ngimobilisasi logam. Kompleks kasebut dipisahaké kanthi efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Kaya sing dituduhake ing Gambar 1, kaloro kompleks kasebut ngemot telung sub-unit RC (RC-L, RC-M lan RC-H) sing diubengi antena LH1. Struktur 2.80-A saka kompleks sing ora duwe protein-W nuduhake 16 heterodimer αβ, mbentuk puteran LH1 tertutup sing ngubengi RC, sing sabanjure diarani kompleks RC-LH116. Struktur 2.65Å saka kompleks sing ngemot protein-W nduweni LH1 14-heterodimer sing diinterupsi dening protein-W, sing sabanjure diarani RC-LH114-W.
(A lan B) Representasi lumahing senyawa kasebut. (C lan D) Pigmen sing kaiket sing diekspresikake ing batang. (E lan F) Kompleks sing diamati saka lumahing sitoplasma duwe peptida lan subunit LH1 sing diwakili ing kartun, lan diwenehi nomer searah jarum jam saka celah protein-W [konsisten karo nomer Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Kanggo LH1-α, warna subunit protein kuning; kanggo LH1-β, warna subunit protein biru; kanggo protein-W, protein abang; kanggo RC-H, warna cyan; kanggo RC-L, warna Oranye; kanggo RC-M, warna magenta. Kofaktor diwakili dening batang, ijo nggambarake molekul BChl lan BPh a, ungu nggambarake karotenoid, lan kuning nggambarake molekul UQ10. (G lan H) Tampilan sing dibesarkan saka celah protein-W ing wilayah sing padha karo kompleks RC-LH114-W (G) lan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ditampilake ing wangun pangisian ruang, kuinon sing dikhelat ditampilake kanthi warna biru. Celah protein-W disorot dening garis putus-putus biru ing (G), lan bolongan cilik ing ngendi kuinon/kuinolol nyebar ing cincin LH116 disorot dening garis putus-putus ireng ing (H).
Gambar 1 (A lan B) nuduhake RC sing diubengi dening susunan heterodimer LH1αβ sing mbukak utawa ditutup, sing saben-saben ngiket rong BChl lan siji karotenoid (Gambar 1, C lan D). Panliten sadurunge nuduhake yen Rps minangka kompleks LH1. Ing jalur biosintesis spirulina xanthin, spesies kasebut ngemot populasi campuran karotenoid (17). Nanging, spiropyrroxanthin minangka karotenoid sing dominan lan kapadhetane cukup. Mulane, kita milih kanggo model spiroxanthin ing kabeh situs pengikatan LH1. Polipeptida alfa lan beta minangka TMH tunggal kanthi wilayah njaba membran cendhak (Gambar 1, A, B, E, lan F). Sanajan kapadhetan 17 residu ing C-terminus ora diamati, polipeptida alfa dibelah saka Met1 dadi Ala46 ing loro kompleks kasebut. Polipeptida β dikurangi saka Gly4 dadi Tyr52 ing RC-LH116, lan saka Ser5 dadi Tyr52 ing RC-LH114-W. Ora ana kapadhetan 3 utawa 4 residu N-terminal utawa 13 residu C-terminal sing diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa saka kompleks RC-LH1 campuran sing disiapake saka galur tipe liar nuduhake yen wilayah sing ilang minangka asil saka pembelahan heterolog saka peptida kasebut (Gambar S1 lan S2). Formilasi N-terminal saka α-Met1 uga diamati (f). Analisis kasebut nuduhake yen α-peptida kasusun saka residu fMet1 nganti Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, lan β-peptida kasusun saka residu Ser2 nganti Ala53, sing cocog karo peta kapadhetan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 lan β-His36 ndadekake BChl adhep-adhepan; saben heterodimer αβ nglumpuk karo tangga teparone kanggo mbentuk loop mbukak (RC-LH114-W) utawa loop tertutup (RC-LH116) ing sekitar RC. Susunan pigmen sing digandeng exciton (Gambar 1, C lan D). Dibandhingake karo pita 877 nm saka RC-LH114-W, pergeseran abang serapan 880 nm saka RC-LH116 yaiku 3 nm (Gambar 2A). Nanging, spektrum dichroism bunder meh padha (Gambar 2B), nuduhake yen sanajan ana bedane sing jelas antarane loop mbukak lan tertutup, lingkungan lokal BChl meh padha. Pergeseran abang serapan bisa uga minangka akibat saka gerakan termal sing suda lan stabilitas sing tambah ing loop tertutup (18, 19), owah-owahan ing kopling pigmen sing disebabake dening loop tertutup (20, 21), utawa kombinasi saka rong efek kasebut (11).
(A) Spektrum serapan ultraviolet/katon/inframerah cedhak, puncak-puncaké ditandhani nganggo pigmen sing cocog lan dinormalisasi dadi puncak BPh ing 775 nm. (B) Spektrum dikroisme bunder sing dinormalisasi dadi serapan BChl ing 805 nm. (C lan D) Spektrum ΔA sing dipilih saka spektrum serapan sing wis dirampungake wektu saka kompleks RC-LH114-W (C) lan kompleks RC-LH116 (D). Kanggo komparabilitas sing luwih apik, kabeh spektrum dinormalisasi dadi ∆A saka −A ing 0,2 ps. (E) Tingkat oksidasi sitokrom c2 sawise iradiasi ing ngarsane macem-macem konsentrasi UQ2 (waca Gambar S8 kanggo data mentah). (F) Ing sel sing thukul ing cahya intensitas rendah, sedang utawa dhuwur (10, 30 utawa 300μMm-2 s-1, masing-masing), subunit protein W lan RC-L ing kompleks sing dimurnèkaké lan rasio membran sing dipisahaké. Nemtokake tingkat protein kanthi elektroforesis gel SDS-poliakrilamida lan immunoassay (waca Gambar S9 kanggo data mentah). Nemtokake rasio relatif marang kompleks RC-LH114-W sing wis dimurnèkaké. Rasio stoikiometrik RC-L karo protein-W saka kompleks kasebut yaiku 1:1.
BChl ing posisi 1 ing loop αβ14 sing cacat saka RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, lan E) luwih cedhak karo donor utama RC (P) kanthi 6,8Å tinimbang BChl sing padha ing RC-LH116 (Gambar 1, B, D, lan F, lan Gambar S3); Nanging, kinetika penyerapan transien saka rong kompleks kasebut nuduhake yen kanggo RC-LH114-W lan RC-LH116, konstanta wektu transfer energi eksitasi saka LH1 menyang RC yaiku 40 ± 4 lan 44 ± 3 ps (Gambar 2). , C lan D, Gambar S4 lan Tabel S2). Uga ora ana bedane sing signifikan ing transfer elektronik ing RC (Gambar S5 lan teks tambahan sing gegandhengan). Kita ngira yen korespondensi sing cedhak saka wektu transfer energi antarane LH1 lan RC-P amarga jarak, sudut, lan energi potensial sing padha saka umume BChl ing rong loop LH1. Koyone njelajah pola energi LH1 kanggo nggayuh jarak minimal ora luwih cepet tinimbang transfer energi langsung saka situs suboptimal menyang RC. Loop LH1 loop terbuka ing RC-LH114-W uga bisa ngalami gerakan termal sing ora signifikan ing kahanan suhu rendah kanggo analisis struktural, lan ana konformasi cincin αβ14 sing luwih dawa ing suhu ruangan saka jarak pigmentasi βBChls ing posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 ngandhut 32 BChl lan 16 karotenoid, lan susunan sakabèhé padha karo sing dipikolehi saka Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), galur Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) lan ganggang ijo (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Sawisé diselarasake, mung ana penyimpangan cilik ing posisi heterodimer αβ sing diamati, utamane 1-5, 15, lan 16 (Gambar S6). Anané protein-W nduwèni dampak sing signifikan marang struktur LH1. Telung TMH-né disambungake déning puteran cendhak, kanthi terminal-N ing sisih lumen kompleks lan terminal-C ing sisih sitoplasma (Gambar 1A lan 3, A nganti D). Protein-W umumé hidrofobik (Gambar 3B), lan TMH2 lan TMH3 sesambungan karo LH1αβ-14 kanggo mbentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B lan E nganti G). Antarmuka utamane kasusun saka residu Phe, Leu lan Val ing wilayah transmembran. Residu kasebut ditumpuk karo asam amino hidrofobik lan pigmen αβ-14. Sawetara residu polar uga nyumbang kanggo interaksi kasebut, kalebu ikatan hidrogen antarane W-Thr68 lan β-Trp42 ing permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F lan G). Ing permukaan sitoplasma, Gln34 jejer karo gugus keto saka karotenoid αβ-14. Kajaba iku, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) wis ilang, lan buntut hidrofobik kasebut ngluwihi antarmuka antarane protein-W lan αβ-14, lan buntut lipid bisa uga ana ing awak. Kita uga nggatekake manawa wilayah resolusi C-terminal protein W lan RCH cedhak banget, nanging ora ana ing ruang lingkup mbentuk interaksi tartamtu (Gambar 1, A lan E). Nanging, bisa uga ana interaksi ing asam amino C-terminal sing durung rampung saka rong protein iki, sing bisa nyedhiyakake mekanisme kanggo rekrutmen protein-W sajrone perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, sing madhep antarmuka karo LH1αβ14 ing wangun kartun, nduweni rantai sisih awujud batang (abang), ditampilake ing bagean diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan kanthi tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W diwakili dening permukaan berwarna hidrofobik. Area polar lan bermuatan ditampilake ing warna cyan, area hidrofobik ditampilake ing warna putih, lan area hidrofobik sing kuwat ditampilake ing warna oranye. (C lan D) Protein-W diwakili ing kartun, orientasine padha karo ing (A) (C), lan diputer 180° (D). Miturut posisi ing urutan kasebut, residu sing bisa dibedakake nggunakake skema warna pelangi, ing ngendi terminal-N biru lan terminal-C abang. (E) Protein-W ing tampilan sing padha karo ing (A), lan residu ing antarmuka protein-W:LH1 diwakili dening batang kanthi tandha sing dipasang. (F) Protein-W diputer 90° relatif marang (E) lan LH1αβ14 ing representasi kartun, lan relatif marang residu antarmuka ing representasi bar. Residu sing nggantung saka polipeptida beta diwenehi label. Kofaktor dituduhake minangka bar sing cocog karo warna Gambar 1, β-DDM sing wis diurai dituduhake kanthi warna abu-abu, lan oksigen dituduhake kanthi warna abang. (G) Tampilan ing (F) diputer 180°, kanthi residu sing nonjol saka polipeptida alfa sing diwenehi label.
Protein-W ngganti heterodimer αβ (kaping 15 ing Gambar 1F), saengga nyegah penutupan loop lan miringake telung heterodimer αβ pisanan. Diamati manawa sudut inklinasi maksimum heterodimer αβ-1 pisanan relatif marang film normal yaiku 25° nganti 29° (Gambar 1, A lan E), sing dibentuk dening inklinasi 2° nganti 8° saka αβ-1 ing RC A kontras sing tajem-LH116 (Gambar 1, B lan F). Heterodimer kapindho lan katelu miring ing 12° nganti 22° lan 5° nganti 10°. Amarga alangan sterik RC, miring αβ-1 ora kalebu pasangan kapindho αβ (sing cocog karo αβ kaping 16 ing Gambar 1F), saengga mbentuk celah sing jelas ing cincin LH1 (Gambar 1, A lan E). Amarga ora ana rong heterodimer αβ, sing dibarengi karo ilangé papat BChl lan rong karotenoid, ora ana karotenoid sing kaiket karo subunit αβ-1 sing bengkong, sing ngasilaké cincin LH114-W sing ngandhut 13 karotenoid Vegetarian lan 28 BChl. Perkiraan resolusi lokal saka rong kompleks ing wilayah αβ1 nganti 7 luwih murah tinimbang karo loop LH1 liyané, sing bisa uga nggambarake plastisitas bawaan saka subunit LH1 sing cedhak karo situs RC QB (Gambar 4).
Gambar-gambar RC-LH114-W (A lan B) lan RC-LH116 (C lan D) dituduhake saka tampilan ndhuwur/tampilan sisih sing padha (A lan B) (A lan C) lan permukaan rongga kaya ing Gambar 1. (B lan D). Tombol-tombol warna dituduhake ing sisih tengen.
Kompleks inti karakteristik liyane kanthi rasio stoikiometrik 1:14 yaiku dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Nanging, protein W lan PufX ora duwe homologi sing jelas, lan duwe pengaruh sing signifikan marang struktur LH1 masing-masing. PufX minangka TMH tunggal kanthi domain sitoplasmik N-terminal sing sesambungan karo sisih sitoplasmik subunit RC-H (13) ing posisi sing cocog karo Rps. palustris LH116αβ-16. PufX nggawe saluran kanggo ijol-ijolan kuinon/kuinolon antarane RC-LH1 lan kompleks sitokrom bcl lan ana ing kabeh kompleks inti Rba. sphaeroides (13). Sanajan antarmuka monomer-monomer ana ing Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX dumunung ing posisi pengikatan protein W ing RC-LH114-W, lan celah sing disebabake dening PufX lan protein-W ana ing posisi sing padha (Gambar S7A). Celah ing RC-LH114-W uga selaras karo saluran kuinon hipotetis (8) saka Pseudomonas rosea LH1, sing dibentuk dening peptida sing ora ana hubungane karo protein W utawa PufX (Gambar S7B). Kajaba iku, saluran kuinon ing Blc. LH1 ijo zamrud sing dibentuk kanthi ngilangi siji subunit γ (7) dumunung ing posisi sing padha (Gambar S7C). Sanajan dimediasi dening protein sing beda, tampilan saluran kuinon/kuinolol iki ing posisi umum ing kompleks RC-LH1 katon minangka conto evolusi konvergen, sing nuduhake yen celah sing digawe dening protein W bisa tumindak minangka saluran kuinon.
Celah ing loop LH114-W ngidini pembentukan wilayah membran terus-terusan antarane ruang internal kompleks RC-LH114-W lan membran massal (Gambar 1G), tinimbang nyambungake rong domain liwat pori protein kaya ing protein. Kompleks RC-LH116 padha karo kompleks kaya jarum Tch sing ditutup (22) (Gambar 1H). Amarga difusi kuinon liwat membran luwih cepet tinimbang difusi liwat saluran protein sing sempit, loop LH114-W sing mbukak bisa ngidini pergantian RC sing luwih cepet tinimbang loop LH116 sing ditutup, lan difusi kuinon menyang RC bisa uga luwih diwatesi. Kanggo nguji apa protein W mengaruhi konversi kuinon liwat RC, kita nindakake uji oksidasi sitokrom ing konsentrasi ubiquinone 2 (UQ2) tartamtu (analog UQ10 alami kanthi buntut isoprena sing luwih cendhek) (Gambar 2E). Senajan anané kuinon khelat ngalangi panentu sing akurat saka konstanta Michaelis sing katon (RC-LH114-W lan RC-LH116 cocog kanggo 0,2 ± 0,1 μM lan 0,5 ± 0,2 μM, mungguh-mungguh), laju maksimum RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) luwih gedhe 28 ± 5% tinimbang RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Wiwitane kita ngira-ngira yen protein-W ana ing udakara 10% saka kompleks inti (16); ing kene, tingkat okupansi sel pertumbuhan cahya kurang, cahya medium, lan cahya dhuwur yaiku 15 ± 0,6%, 11 ± 1% lan 0,9 ± 0,5, masing-masing % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa nuduhake yen tambahan tag histidin ora nyuda kelimpahan relatif protein-W dibandhingake karo galur tipe liar (P = 0,59), mula tingkat kasebut dudu artefak saka protein-W sing dimodifikasi (Gambar S10). Nanging, okupansi protein-W sing kurang ing kompleks RC-LH1 iki bisa ngidini sawetara RC kanggo muter kanthi tingkat sing luwih cepet, saengga nyuda ijol-ijolan kuinon/kuinolon sing luwih alon ing kompleks RC-LH116. Kita weruh yen tingkat okupansi cahya sing dhuwur ora konsisten karo data transkriptomik anyar, sing nuduhake yen ekspresi gen pufW mundhak ing cahya sing kuwat (Gambar S11) (23). Bentenane antarane transkripsi pufW lan penggabungan protein-W menyang kompleks RC-LH1 iku mbingungake lan bisa uga nggambarake regulasi kompleks protein kasebut.
Ing RC-LH114-W, 6 molekul kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) lan 29 molekul β-DDM dialokasikan lan dimodelkan ing njero 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG lan 12 βDDM. RC-LH116 (Gambar 5, A lan B). Ing rong struktur iki, CDL meh dumunung ing sisih sitoplasma kompleks, dene POPC, POPG lan β-DDM umume dumunung ing sisih luminal. Rong molekul lipid lan deterjen diisolasi ing wilayah αβ-1 nganti αβ-6 saka kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), lan lima diisolasi ing wilayah sing padha karo RC-LH116 (Gambar 5B). Luwih akeh lipid ditemokake ing sisih liyane saka kompleks kasebut, utamane CDL, sing nglumpuk ing antarane RC lan αβ-7 nganti αβ-13 (Gambar 5, A lan B). Lipid lan deterjen liyane sing wis mapan sacara struktural dumunung ing njaba cincin LH1, lan rantai asil sing mapan kanthi apik ngluwihi antarane subunit LH1, sing sementara ditetepake minangka β-DDM ing RC-LH114-W, lan ditetepake minangka β-DDM ing campuran RC saka β-DDM lan POPC-LH116. Posisi lipid lan deterjen chelating sing padha ing struktur kita nuduhake yen dheweke minangka situs pengikatan sing relevan sacara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul sing padha ing Tch uga duwe konsistensi sing apik. Gentle lan Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambar S12, B nganti E) (9, 12) lan residu ikatan hidrogen saka klompok sirah lipid nuduhake konservasi sing cukup apik ing alignment urutan (Gambar S13), sing nuduhake yen CDL sing dilestarikan sing kaiket karo RC (24), situs kasebut bisa dilestarikake ing kompleks RC-LH1.
(A lan B) Peptida RC-LH114-W (A) lan RC-LH116 (B) diwakili dening kartun, lan pigmen diwakili dening batang, nggunakake skema warna ing Gambar 1. Lipid dituduhake kanthi warna abang, lan deterjen dituduhake kanthi warna abu-abu. UQ sing kaiket karo situs RC QA lan QB warnane kuning, dene UQ sing diisolasi warnane biru. (C lan D) Tampilan sing padha karo (A) lan (B), kanthi lipid sing diilangi. (E nganti G) Tampilan Q1(E), Q2(F) lan Q3(G) sing digedhekake saka RC-LH116, kanthi rantai samping sing saling mengaruhi. Ikatan hidrogen dituduhake minangka garis putus-putus ireng.
Ing RC-LH116, RC QA lan QB UQ, sing melu transfer elektron ing proses pamisahan muatan, diurai ing situs pengikatane. Nanging, ing RC-LH114-W, QB kuinon durung dipecah lan bakal dirembug kanthi rinci ing ngisor iki. Saliyane QA lan QB kuinon, rong molekul UQ sing dikhelat (dumunung ing antarane cincin RC lan LH1) dialokasikan ing struktur RC-LH114-W miturut klompok sirah sing dipecah kanthi apik (dumunung ing Q1 lan Q2). ruang). Gambar 5C). Rong unit isoprena ditugasake menyang Q1, lan peta kapadhetan ngrampungake 10 buntut isoprena lengkap saka Q2. Ing struktur RC-LH116, telung molekul UQ10 sing dikhelat (Q1 nganti Q3, Gambar 5D) dipecah, lan kabeh molekul duwe kapadhetan sing jelas ing saindenging buntut (Gambar 5, D nganti G). Ing rong struktur kasebut, posisi gugus sirah kuinon Q1 lan Q2 nduweni konsistensi sing apik banget (Gambar S12F), lan mung sesambungan karo RC. Q1 dumunung ing lawang celah W RC-LH114-W (Gambar 1G lan 5, C, D lan E), lan Q2 dumunung cedhak situs pengikatan QB (Gambar 5, C, D) lan F). Residu L-Trp143 lan L-Trp269 sing dilestarikake cedhak banget karo Q1 lan Q2 lan nyedhiyakake interaksi π-stacking potensial (Gambar 5, E lan F, lan Gambar S12). L-Gln88, 3.0 Å saka oksigen distal Q1, nyedhiyakake ikatan hidrogen sing kuwat (Gambar 5E); residu iki dilestarikake ing kabeh RC kajaba hubungan sing paling adoh (Gambar S13). L-Ser91 diganti kanthi konservatif kanggo Thr ing umume RC liyane (Gambar S13), yaiku 3,8 Angstrom saka metil oksigen Q1, lan bisa nyedhiyakake ikatan hidrogen sing ringkih (Gambar 5E). Q3 katon ora duwe interaksi tartamtu, nanging dumunung ing wilayah hidrofobik antarane subunit RC-M lan subunit LH1-α 5 nganti 6 (Gambar 5, D lan G). Q1, Q2 lan Q3 utawa kuinon khelat sing cedhak uga wis diatasi ing Tch. Gentle, Trv. Strain 970 lan Blc. Struktur iris (9, 10, 12) nuduhake situs pengikatan kuinon tambahan sing dilestarikan ing kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ sing wis diurai ing RC-LH116 cocog karo 5,8 ± 0,7 saka saben kompleks sing ditemtokake dening kromatografi cair kinerja dhuwur (HPLC), dene telung UQ sing wis diurai ing RC-LH114-W luwih murah tinimbang Nilai sing diukur 6,2 ± 0,3 (Gambar S14) nuduhake yen ana molekul UQ sing durung diurai ing struktur kasebut.
Polipeptida L lan M pseudo-simetris saben-saben ngandhut limang TMH lan mbentuk heterodimer sing nggabungake siji dimer BChl, rong monomer BChl, rong monomer bakteriofag (BPh), lan siji wesi non-Heme lan siji utawa loro molekul UQ10. Liwat anané ikatan hidrogen ing gugus keton terminal lan akumulasi sing dikenal ing Rps, karotenoid digabungake ing subunit-M, sing dijenengi cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesies (25). Domain membran njaba RC-H diikat menyang membran dening siji TMH. Struktur RC sakabèhé padha karo telung subunit RC saka spesies sing gegandhèngan (kayata Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl lan BPh, balung mburi karotenoid lan wesi non-heme tumpang tindih ing kisaran resolusi struktur kasebut, kaya gugus sirah UQ10 ing situs QA lan kuinon QB ing RC-LH116 (Gambar S15).
Kasedhiyan rong struktur RC kanthi tingkat okupansi situs QB sing beda-beda menehi kesempatan anyar kanggo mriksa owah-owahan konformasi sing konsisten sing diiringi pengikatan QB quinone. Ing kompleks RC-LH116, QB quinone dumunung ing posisi "proksimal" sing kaiket kanthi lengkap (26), nanging pamisahan RC-LH114-W ora duwe QB quinone. Ora ana QB quinone ing RC-LH114-W, sing nggumunake amarga kompleks kasebut aktif, luwih aktif tinimbang kompleks RC-LH116 kanthi QB quinone sing diatasi kanthi struktural. Sanajan rong cincin LH1 ngelat udakara enem kuinon, lima diatasi kanthi struktural ing cincin RC-LH116 sing ditutup, dene mung telu sing diwatesi sacara struktural ing cincin RC-LH114-W sing mbukak. Kelainan struktural sing tambah iki bisa uga nggambarake panggantos situs QB RC-LH114-W sing luwih cepet, kinetika kuinon sing luwih cepet ing kompleks kasebut, lan kemungkinan sing tambah nyebrang loop LH1. Kita ngusulake yen ora anane UQ ing situs RC QB saka RC-LH114-W bisa uga minangka akibat saka kompleks sing luwih kompleks lan luwih aktif, lan situs QB saka RC-LH114-W wis langsung beku ing pergantian UQ. Tahap tartamtu (lawang mlebu menyang situs QB wis ditutup) nuduhake konformasi aktivitas iki.
Tanpa QB, rotasi L-Phe217 sing diiringi menyang posisi sing ora kompatibel karo ikatan UQ10, amarga bakal nyebabake tabrakan spasial karo unit isoprena pertama buntut (Gambar 6A). Kajaba iku, owah-owahan konformasi utama sing jelas jelas, utamane helix de (helix cendhak ing loop antarane TMH D lan E) ing ngendi L-Phe217 dipindhah menyang kanthong ikatan QB lan rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) Kanggo medhot ikatan hidrogen karo kerangka M-Asp45 lan nutup lawang mlebu situs ikatan QB (Gambar 6B). Helix de pivots ing dhasare, Cα saka L-Ser209 digeser 0,33Å, dene L-Val221Cα digeser 3,52Å. Ora ana owah-owahan sing bisa diamati ing TMH D lan E, sing bisa ditumpangake ing loro struktur (Gambar 6A). Sakwruh kita, iki minangka struktur pertama ing RC alami sing nutup situs QB. Perbandingan karo struktur lengkap (kaiket QB) nuduhake yen sadurunge kuinon direduksi, owah-owahan konformasi dibutuhake supaya bisa mlebu ing kuinon. L-Phe217 muter kanggo mbentuk interaksi π-susun karo klompok sirah kuinon, lan heliks kasebut obah metu, saengga kerangka L-Gly222 lan rantai samping L-Tyr223 mbentuk jaringan ikatan hidrogen kanthi struktur ikatan hidrogen sing stabil (Gambar 6, A lan C).
(A) Kartun hologram sing tumpang tindih (rantai L, oranye/rantai M, magenta) lan struktur apo (abu-abu), ing ngendi residu kunci ditampilake ing wangun representasi kaya batang. UQ10 diwakili dening garis kuning. Garis putus-putus nuduhake ikatan hidrogen sing kawangun ing kabeh struktur. (B lan C) Representasi permukaan apolipoprotein lan kabeh struktur cincin, sing nyorot oksigen rantai samping L-Phe217 kanthi warna biru lan L-Tyr223 kanthi warna abang. Subunit L warnane oranye; subunit M lan H ora diwarnai. (D lan E) Apolipoprotein (D) lan kabeh (E) situs RC QB [warna miturut (A)] lan Thermophilus thermophilus PSII (ijo, biru kanthi kuinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajar (58).
Tanpa diduga, sanajan ana sawetara struktur RC sing kekurangan QB tanpa LH1, owah-owahan konformasi sing diamati ing panliten iki durung dilaporake sadurunge. Iki kalebu struktur penipisan QB saka Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) lan Rba. sphaeroides (ID PDB: 1OGV) (29), kabeh meh padha karo struktur QB sakabèhé. Pamriksaan sing rapet marang 3PRC nuduhake yen molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) kaiket ing lawang posisi QB, sing bisa nyegah penyusunan ulang dadi konformasi sing ditutup. Sanajan LDAO ora bosok ing posisi sing padha ing 1EYS utawa 1OGV, RC iki disiapake nggunakake deterjen sing padha lan mulane bisa ngasilake efek sing padha. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC sing dikristalisasi bebarengan karo sitokrom c2 (ID PDB: 1L9B) uga katon duwe situs QB sing ditutup. Nanging, ing kasus iki, wilayah N-terminal saka polipeptida RC-M (sing sesambungan karo situs pengikatan QB liwat ikatan H saka residu Tyr ing heliks Q) nggunakake konformasi sing ora wajar, lan owah-owahan konformasi QB ora diteliti luwih lanjut (30). Sing nentremake yaiku kita durung weruh deformasi polipeptida M kaya iki ing struktur RC-LH114-W, sing meh padha karo wilayah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu uga dicathet yen sawise eradikasi antena LH1 berbasis deterjen, RC apolipoprotein ing PDB wis ilang, sing ngilangi blumbang kuinon internal lan lipid ing celah antarane RC lan permukaan njero cincin LH1 ing sekitar (31, 32). RC tetep berfungsi amarga nahan kabeh kofaktor, kajaba QB quinone sing bisa diurai, sing kurang stabil lan asring ilang sajrone proses persiapan (33). Kajaba iku, dingerteni manawa mbusak LH1 lan lipid siklik alami saka RC bisa duwe pengaruh marang fungsi, kayata umur sing luwih cendhek saka kahanan P+QB sing dipisahake muatan (31, 34, 35). Mulane, kita berspekulasi manawa anane cincin LH1 lokal sing ngubengi RC bisa njaga situs QB "tertutup", saengga njaga lingkungan lokal cedhak QB.
Sanajan apolipoprotein (tanpa QB quinone) lan struktur lengkap mung makili rong gambaran saka pergantian situs QB, tinimbang serangkaian acara, ana indikasi yen pengikatan kasebut bisa dikunci kanggo nyegah pengikatan maneh dening hidrokuinon Kanggo nyegah inhibisi substrat. Interaksi quinolol lan quinone cedhak situs QB apolipoprotein bisa uga beda, sing nyebabake penolakan dening RC. Wis suwe diusulake yen owah-owahan konformasi nduweni peran ing pengikatan lan reduksi kuinon. Kemampuan RC beku kanggo nyuda kuinon sawise adaptasi peteng diganggu (36); Kristalografi sinar-X nuduhake yen kerusakan iki amarga kuinon QB kejebak ing konformasi "distal" udakara 4,5 Å saka posisi proksimal aktif (26), 37). Kita saranake yen konformasi pengikatan distal iki minangka gambaran saka kahanan antara antarane apolipoprotein lan struktur cincin lengkap, sing ngetutake interaksi awal karo kuinon lan pambukaan situs QB.
RC tipe II sing ditemokake ing kompleks PSII saka bakteri fototrofik tartamtu lan cyanobacteria, ganggang lan tanduran nduweni konservasi struktural lan fungsional (38). Keselarasan struktural sing dituduhake ing Gambar 6 (D lan E) nandheske kamiripan antarane RC PSII lan situs QB saka kompleks RC bakteri. Perbandingan iki wis suwe dadi model kanggo nyinaoni sistem pengikatan lan reduksi kuinon sing raket banget. Publikasi sadurunge nyaranake manawa owah-owahan konformasi diiringi dening reduksi kuinon PSII (39, 40). Mulane, ngelingi konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikatan sing sadurunge ora diamati iki uga bisa ditrapake ing situs QB RC PSII ing tanduran fototrofik oksigen.
Rps ΔpufW (pambusakan pufW tanpa label) lan galur PufW-His (protein-W sing ditandhani C-terminal 10x His sing diekspresikan saka lokus pufW alami). palustris CGA009 diterangake ing karya sadurunge (16). Galur iki lan induk tipe liar isogenik dijupuk saka mesin pembeku kanthi ngethok sawetara sel ing piring PYE (saben 5 g liter -1) (disimpen ing LB ing suhu -80 °C, ngemot 50% (w/v) gliserol) protein, ekstrak ragi lan agar suksinat) [1,5% (w/v)]. Piring kasebut diinkubasi sewengi ing peteng ing suhu kamar ing kahanan anaerob, banjur disinari nganggo cahya putih (~50 μmolm-2 s-1) sing diwenehake dening bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) sajrone 3 nganti 5 dina nganti koloni tunggal katon. Koloni tunggal digunakake kanggo nginokulasi 10 ml medium M22+ (41) sing ditambah karo asam kasamino 0,1% (w/v) (sabanjure diarani M22). Kultur kasebut ditandur ing kahanan oksigen rendah ing peteng ing suhu 34°C kanthi digoyang ing 180 rpm sajrone 48 jam, banjur 70 ml kultur kasebut diinokulasi ing kahanan sing padha sajrone 24 jam. Kultur semi-aerobik kanthi volume 1 ml digunakake kanggo nginokulasi 30 ml medium M22 ing botol kaca transparan sekrup universal 30 ml lan disinari nganggo agitasi (~50μmolm-2 s-1) sajrone 48 jam kanthi gaya magnet steril Batang pengaduk. Banjur 30 ml kultur kasebut diinokulasi karo udakara 1 liter kultur ing kahanan sing padha, sing banjur digunakake kanggo nginokulasi udakara 9 liter kultur sing disinari ing ~200 μmolm-2 s-1 sajrone 72 jam. Sel-sel kasebut dipanen kanthi sentrifugasi ing 7132 RCF sajrone 30 menit, disuspensi maneh ing ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), lan disimpen ing suhu -20°C nganti dibutuhake.
Sawisé dicairke, tambahake sawetara kristal deoxyribonuclease I (Merck, UK), lisozim (Merck, UK) lan rong tablet Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, UK) menyang sel sing disuspensi maneh. Ing sel tekanan Prancis 20.000 psi (Aminco, USA), sel-sel kasebut diganggu kaping 8 nganti 12. Sawise mbusak sel sing ora rusak lan lebu sing ora larut kanthi sentrifugasi ing 18.500 RCF sajrone 15 menit ing suhu 4°C, membran kasebut diendapkan saka lisat pigmen kanthi sentrifugasi ing 113.000 RCF sajrone 2 jam ing suhu 43.000°C. Buang fraksi sing larut lan suspensi maneh membran sing diwernani ing 100 nganti 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) lan homogenake nganti ora ana agregat sing katon. Membran sing digantung diinkubasi ing 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) sing ngandhut 2% (w/v) β-DDM sajrone 1 jam ing peteng ing suhu 4°C kanthi diaduk alon-alon. Banjur centrifuge ing 70°C kanggo nglarutake 150.000 RCF ing suhu 4°C sajrone 1 jam kanggo mbusak sisa-sisa sing ora larut.
Membran pelarut saka galur ΔpufW diterapake ing kolom ijol-ijolan ion DEAE Sepharose 50 ml kanthi volume telung kolom (CV) buffer pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8.0) sing ngandhut 0,03% (w/v) β-DDM]. Cuci kolom nganggo rong buffer pengikat CV, banjur cuci kolom nganggo rong buffer pengikat sing ngandhut 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 dielusi kanthi gradien linier 150 nganti 300 mM NaCl (ing buffer pengikat) ing 1,75 CV, lan kompleks pengikat sing isih ana dielusi nganggo buffer pengikat sing ngandhut 300 mM NaCl ing 0,5 CV. Kumpulake spektrum panyerepan antarane 250 lan 1000 nm, jaga fraksi kanthi rasio absorbansi (A880/A280) luwih saka 1 ing 880 nganti 280 nm, encerake kaping pindho ing buffer pengikat, lan gunakake prosedur sing padha maneh ing kolom DEAE Ing pemurnian. Encerake fraksi kanthi rasio A880/A280 sing luwih dhuwur tinimbang 1,7 lan rasio A880/A805 sing luwih dhuwur tinimbang 3,0, lakoni babak katelu pertukaran ion, lan simpen fraksi kanthi rasio A880/A280 sing luwih dhuwur tinimbang 2,2 lan rasio A880/A805 sing luwih dhuwur tinimbang 5,0. Kompleks sing wis dimurnèkaké sebagian dikonsentrasikaké nganti ~2 ml ing filter sentrifugal Amicon 100.000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), lan dimuat ing kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) sing ngandhut buffer NaCl 200 mM, banjur dielusi ing buffer sing padha ing 1,5 CV. Kumpulake spektrum panyerepan saka fraksi pengecualian ukuran, lan konsentrasikake spektrum panyerepan kanthi rasio A880/A280 luwih saka 2,4 lan rasio A880/A805 luwih saka 5,8 nganti 100 A880, lan langsung gunakake kanggo persiapan utawa panyimpenan grid cryo-TEM. Simpen ing suhu -80°C nganti dibutuhake.
Membran pelarut saka galur PufW-His diterapake ing kolom HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) sing ngandhut 200 mM NaCl lan 0.03% (w/w)) ing buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom kasebut dikumbah nganggo limang CV buffer IMAC, banjur nganggo limang CV buffer IMAC sing ngandhut 10 mM histidin. Kompleks inti dielusi saka kolom nganggo limang buffer IMAC sing ngandhut 100 mM histidin. Fraksi sing ngandhut kompleks RC-LH114-W dikonsentrasikake dadi ~10 ml ing tangki sing diaduk sing dilengkapi filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), diencerake kaping 20 nganggo buffer pengikat, banjur ditambahake dadi 25 ml Ing kolom DEAE Sepharose, papat CV sing kaiket ing buffer digunakake luwih dhisik. Wisuh kolom nganggo papat buffer pengikat CV, banjur elusi kompleks ing wolung CV kanthi gradien linier 0 nganti 100 mM NaCl (ing buffer pengikat), lan papat CV sing isih ana ngemot buffer pengikat 100 mM. Kompleks residual sing dielusi ing natrium klorida sing digabungake karo rasio A880/A280 sing luwih dhuwur tinimbang 2,4 lan rasio A880/A805 sing luwih dhuwur tinimbang 4,6 fraksi dikonsentrasikake dadi ~2 ml ing filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, lan diisi karo 1,5 CV IMAC sadurunge. Buffer nyeimbangake kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600, banjur dielusi ing buffer sing padha kanthi 1,5 CV. Kumpulake spektrum panyerepan saka fraksi eksklusi ukuran lan konsentrasikake spektrum panyerepan nganggo rasio A880/A280 luwih saka 2,1 lan rasio A880/A805 luwih saka 4,6 nganti 100 A880, sing langsung digunakake kanggo persiapan kisi TEM beku utawa disimpen ing suhu -80°C nganti dibutuhake.
Freezer rendam Leica EM GP digunakake kanggo nyiyapake kisi-kisi TEM suhu rendah. Kompleks kasebut diencerake ing buffer IMAC nganti A880 50, banjur 5μl dimuat menyang jaring tembaga dilapisi karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 sing mentas disinari cahya (Agar Scientific, UK). Inkubasi kisi-kisi ing suhu 20°C lan kelembapan relatif 60% sajrone 30 detik, banjur garingake sajrone 3 detik, banjur ndinginake ing etana cair ing -176°C.
Data saka kompleks RC-LH114-W direkam ing eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) nganggo mikroskop Titan Krios, sing makarya kanthi voltase akselerasi 300kV, kanthi pembesaran nominal 130.000× lan energi 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum nganggo detektor puncak K2 digunakake kanggo ngrekam gambar ing mode cacah kanggo ngumpulake data. Ukuran piksel sing dikalibrasi yaiku 1,048Å, lan tingkat dosis yaiku 3,83 e-Å-2s-1. Ngumpulake film sajrone 11 detik lan dipérang dadi 40 bagean. Gunakake area sing dilapisi karbon kanggo fokus maneh mikroskop, banjur ngumpulake telung film saben bolongan. Sakabèhé, ana 3130 film sing dikumpulake, kanthi nilai defokus antarane -1 lan -3μm.
Data kanggo kompleks RC-LH116 dikumpulake nggunakake mikroskop sing padha ing Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data kasebut dikumpulake ing mode cacah kanthi pembesaran 130 k, lan ukuran piksel dikalibrasi dadi 1,065 Å kanthi dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film kasebut direkam sajrone 12 detik lan dipérang dadi 48 bagean. Sakabèhé, ana 3359 film sing dikumpulake, kanthi nilai defokus antarane -1 lan -3μm.
Kabeh pangolahan data ditindakake ing pipa Relion 3.0 (42). Gunakake Motioncorr 2 (43) kanggo mbenerake gerakan sinar kanthi bobot dosis, banjur gunakake CTFFIND 4.1 (44) kanggo nemtokake parameter CTF (fungsi transfer kontras). Fotomikrograf khas sawise tahapan pangolahan awal iki dituduhake ing Gambar 2. S16. Cithakan pilihan otomatis digawe kanthi milih kanthi manual udakara 250 piksel saka 1000 partikel ing pigura 250 piksel lan ora ana klasifikasi rong dimensi (2D) referensi, saengga nolak klasifikasi kasebut sing memenuhi kontaminasi sampel utawa ora duwe karakteristik sing bisa dibedakake. Banjur, pilihan otomatis ditindakake ing kabeh mikrofotograf, lan RC-LH114-W ana 849.359 partikel, lan kompleks RC-LH116 ana 476.547 partikel. Kabeh partikel sing dipilih wis ngalami rong babak klasifikasi 2D non-referensi, lan sawise saben proses, partikel sing ketemu area karbon, kontaminasi sampel, ora ana fitur sing jelas utawa partikel sing tumpang tindih banget ditolak, sing nyebabake 772.033 (90,9%) lan 359.678 (75,5%) Partikel digunakake kanggo klasifikasi 3D RC-LH114-W lan RC-LH116. Model referensi 3D awal digawe nggunakake metode penurunan gradien stokastik. Nggunakake model awal minangka referensi, partikel sing dipilih diklasifikasikake dadi patang kategori ing 3D. Nggunakake model ing kategori iki minangka referensi, nindakake pemurnian 3D ing partikel ing kategori paling gedhe, banjur gunakake filter low-pass 15Å awal kanggo nutupi area pelarut, tambahake 6 piksel pinggiran alus, lan pasca-proses piksel kanggo mbenerake fungsi transfer Modulasi puncak Gatan K2 saka detektor ndhuwur. Kanggo dataset RC-LH114-W, model awal iki diowahi kanthi mbusak kapadhetan sing kuwat ing pinggir topeng (dipedhot saka kapadhetan kompleks inti ing UCSF Chimera). Model sing diasilake (resolusi RC-LH114-W lan RC-LH116 yaiku 3,91 lan 4,16 Å) digunakake minangka referensi kanggo babak kapindho klasifikasi 3D. Partikel sing digunakake dikelompokake menyang kelas 3D awal lan ora ngemot korelasi sing kuwat karo lingkungan sekitar. Tumpang tindih utawa ora ana fitur struktural sing jelas. Sawise babak kapindho klasifikasi 3D, kategori kanthi resolusi paling dhuwur dipilih [Kanggo RC-LH114-W, siji kategori yaiku 377.703 partikel (44,5%), kanggo RC-LH116, ana rong kategori, kanthi total 260.752 partikel (54,7%), ing ngendi padha mung nalika disejajarkan sawise rotasi awal kanthi beda cilik]. Partikel-partikel sing dipilih diekstrak maneh ing kothak 400 piksel lan dimurnikake kanthi pemurnian 3D. Topeng pelarut digawe nggunakake filter low-pass awal 15Å, ekspansi peta 3 piksel, lan topeng alus 3 piksel. Nggunakake pemurnian CTF per-partikel, koreksi gerakan per-partikel, lan babak kapindho pemurnian CTF per-partikel, pemurnian 3D, pemurnian pelarut, lan pasca-pemrosesan ditindakake sawise saben langkah kanggo luwih nyaring tekstur sing diasilake. Nggunakake nilai cut-off FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0,143, resolusi model pungkasan RC-LH114-W lan RC-LH116 yaiku 2,65 lan 2,80Å. Kurva FSC saka model pungkasan dituduhake ing Gambar 2. S17.
Kabeh urutan protein diunduh saka UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) digunakake kanggo mbangun model homologi RC, sing ngemot urutan protein RC-L, RC-M lan RC-H lan struktur kristal Rba. sphaeroides RC digunakake minangka cithakan (PDB ID: 5LSE) (46). Gunakna alat "fit map" ing UCSF Chimera kanggo nyocogake model sing digawe menyang peta (47), ningkatake struktur protein, lan kofaktor [4×BChl a (jeneng residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), siji utawa rong jinis UQ10 (U10), siji wesi non-heme (Fe) lan siji 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] gunakake Coot (48) kanggo nambahake. Amarga QAK ora kasedhiya ing perpustakaan monomer, mula diparameterisasi nggunakake alat eLBOW ing PHENIX (49).
Sabanjure, subunit LH1 dibangun. Kaping pisanan, alat konstruksi otomatis ing PHENIX (49) digunakake kanggo mbangun bagean saka urutan LH1 kanthi otomatis nggunakake peta lan urutan protein LH1-α lan LH1-β minangka input. Pilih subunit LH1 sing paling lengkap, ekstrak lan muat menyang Coot, tambahake urutan sing ilang kanthi manual, lan saring kabeh struktur kanthi manual sadurunge nambahake rong BCl (BCL) lan spirilloxanthin (CRT) [miturut Rps sing relevan Kapadhetan kompleks LH1 lan isi karotenoid sing dikenal. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 lengkap, lan gunakake UCSF Chimera "Docking Map Tool" kanggo nglampirake ing area non-model sing jejer karo kapadhetan LH1, banjur saring ing Coot; baleni proses kasebut nganti kabeh subunit LH1 wis dimodelake. Kanggo struktur RC-LH114-W, kanthi ngekstrak kapadhetan sing ora dialokasikan ing Coot, protein kasebut dipisahake saka komponen non-protein sing isih ana ing peta USCF Chimera lan alat Autobuild digunakake kanggo netepake model awal, lan subunit sing isih ana (protein-W) Pemodelan. Ing PHENIX (49). Tambah urutan sing ilang menyang model sing diasilake ing Coot (48), banjur saring kabeh subunit kanthi manual. Kapadhetan sing isih ora dialokasikan cocog karo kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB saka CDL = CDL, POPC = 6PL lan POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) lan molekul UQ10 (U10). Gunakake optimasi PHENIX (49) lan optimasi manual ing Coot (48) kanggo nyempurnakake model awal lengkap nganti statistik model lan kualitas visual sing cocog ora bisa ditingkatake maneh. Pungkasan, gunakake LocScale (50) kanggo ngasah peta lokal, banjur tindakake sawetara siklus liyane kanggo pemodelan kapadhetan sing ora dialokasikan lan optimasi otomatis lan manual.
Peptida, kofaktor, lan lipid lan kuinon liyane sing ana ing kapadhetan masing-masing dituduhake ing Gambar 1 lan 2. S18 nganti S23. Informasi statistik model pungkasan dituduhake ing Tabel S1.
Kajaba ditemtokake liya, spektrum panyerepan UV/Vis/NIR dikumpulake ing spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) kanthi interval 1 nm saka 250 nm nganti 1000 nm lan wektu integrasi 0,1 detik.
Encerake sampel ing kuvet kuarsa kanthi jalur 2 mm nganti A880 saka 1, lan kumpulake spektrum panyerepan antarane 400 lan 1000 nm. Spektrum dikroik bunder dikumpulake ing spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) kanthi interval 1 nm antarane 400 nm lan 950 nm kanthi kecepatan pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar ditemtokake kanthi ngencerake kompleks inti dadi A880 kira-kira 50. Encerake volume 10μl ing buffer pengikat 990μl utawa metanol, lan kumpulake spektrum panyerepan langsung kanggo nyuda degradasi BChl. Kandungan BChl saben sampel metanol diitung nganggo koefisien kepunahan ing 771 nm saka 54,8 mM-1 cm-1, lan koefisien kepunahan ditemtokake (51). Bagi konsentrasi BChl sing diukur karo 32 (RC-LH114-W) utawa 36 (RC-LH116) kanggo nemtokake konsentrasi kompleks inti, sing banjur digunakake kanggo nemtokake spektrum panyerepan saka sampel sing padha sing dikumpulake ing koefisien kepunahan buffer. Telung pangukuran bola-bali dijupuk kanggo saben sampel, lan absorbansi rata-rata maksimum BChl Qy digunakake kanggo pitungan. Koefisien kepunahan RC-LH114-W sing diukur ing 878 nm yaiku 3280±140 mM-1 cm-1, dene koefisien kepunahan RC-LH116 sing diukur ing 880 nm yaiku 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukur miturut metode ing (52). Cekakipun, HPLC fase balik (RP-HPLC) ditindakake nggunakake sistem Agilent 1200 HPLC. Larutake udakara 0,02 nmol RC-LH116 utawa RC-LH114-W ing 50μl metanol:kloroform 50:50 sing ngemot 0,02% (w/v) ferik klorida, lan suntikake Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm sing wis diseimbangake Larutake ing 1 ml-1 min-1 ing suhu 40°C ing pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) ing kolom ×25 cm. Lakoni elusi isokratik ing pelarut HPLC kanggo ngawasi absorbansi ing 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) lan 780 nm (BChl) sajrone 1 jam. Puncak ing kromatogram 275 nm ing 25,5 menit diintegrasikake, sing ora ngemot senyawa liyane sing bisa dideteksi. Area terintegrasi digunakake kanggo ngetung jumlah molar UQ10 sing diekstrak kanthi referensi kurva kalibrasi sing diitung saka injeksi standar murni saka 0 nganti 5,8 nmol (Gambar S14). Saben sampel dianalisis ing telung ulangan, lan kesalahan sing dilapurake cocog karo SD rata-rata.
Larutan sing ngandhut kompleks RC-LH1 kanthi panyerepan Qy maksimal 0,1 disiapake nganggo 30 μM sitokrom jantung jaran sing direduksi c2 (Merck, UK) lan 0 nganti 50 μMUQ2 (Merck, UK). Telung sampel 1-ml disiapake ing saben konsentrasi UQ2 lan diinkubasi sewengi ing peteng ing suhu 4°C kanggo njamin adaptasi lengkap menyang peteng sadurunge pangukuran. Larutan kasebut dimuat menyang spektrofotometer modular OLIS RSM1000 sing dilengkapi kisi api 300 nm/500 garis, inlet 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm lan celah outlet 0,6 mm. Filter pass dawa 600 nm diselehake ing lawang phototube sampel lan tabung photomultiplier referensi kanggo ngilangi cahya eksitasi. Absorbansi dipantau ing 550 nm kanthi wektu integrasi 0,15 s. Cahya eksitasi dipancarake saka LED (Light Emitting Diode) M880 nm (Thorlabs Ltd., UK) liwat kabel serat optik kanthi intensitas 90% liwat pengontrol DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) lan dipancarake menyang sumber cahya kanthi sudut 90°. Sinar pangukur dideleng saka pangilon kanggo ngasilake cahya sing wiwitane ora diserep dening sampel. Pantau absorbansi 10 detik sadurunge katerangan 50 detik. Banjur absorbansi luwih lanjut dipantau sajrone 60 detik ing peteng kanggo netepake sepira quinolol kanthi spontan nyuda sitokrom c23+ (waca Gambar S8 kanggo data mentah).
Data kasebut diolah kanthi nyetel laju awal linier sajrone 0,5 nganti 10 detik (gumantung saka konsentrasi UQ2) lan rata-rata laju kabeh telung sampel ing saben konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 sing diitung nganggo koefisien kepunahan masing-masing digunakake kanggo ngowahi laju kasebut dadi efisiensi katalitik, sing diplot ing Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), lan dipasang ing model Michaelis-Menten kanggo nemtokake nilai Km lan Kcat sing katon.
Kanggo pangukuran panyerepan sementara, sampel RC-LH1 diencerake dadi ~2μM ing buffer IMAC sing ngemot 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) lan 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Asam askorbat digunakake minangka donor elektron kurban, lan tert-butaclofen digunakake minangka inhibitor QB kanggo mesthekake yen donor RC utama tetep suda (yaiku, ora difotooksidasi) sajrone proses pangukuran. Kira-kira 3 ml sampel ditambahake menyang sel puteran khusus (diameter udakara 0,1 m, 350 RPM) kanthi dawa jalur optik 2 mm kanggo mesthekake yen sampel ing jalur laser duwe wektu sing cukup kanggo adaptasi peteng antarane pulsa eksitasi. Gunakake pulsa laser ~100-fs kanggo nggedhekake sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) kanggo ngrangsang sampel ing 880 nm kanthi tingkat pengulangan 1 kHz (20 nJ kanggo NIR utawa 100 nJ kanggo Vis). Sadurunge ngumpulake data, kena cahya eksitasi sajrone kurang luwih 30 menit. Paparan bakal nyebabake inaktivasi QA (bisa uga nyuda QA sapisan utawa kaping pindho). Nanging elinga yen proses iki bisa dibatalake amarga sawise adaptasi peteng sing suwe, RC bakal alon-alon bali menyang aktivitas QA. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) digunakake kanggo ngukur spektrum transien kanthi wektu tundha -10 nganti 7000 ps. Gunakake piranti lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) kanggo misahake set data, banjur gabung lan standarisasi. Gunakake paket piranti lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) kanggo nggunakake set data gabungan kanggo entuk spektrum diferensial sing ana gandhengane karo bosok, utawa gunakake fungsi sing nggabungake pirang-pirang eksponen karo respon instrumen supaya cocog karo evolusi spektrum dawa gelombang tunggal ing Origin (OriginLab, USA).
Kaya sing wis kasebut ing ndhuwur (53), film fotosintetik sing ngemot kompleks LH1 sing ora duwe antena RC lan periferal LH2 wis disiapake. Membran kasebut diencerake ing 20 mM tris (pH 8.0) banjur dilebokake ing kuvet kuarsa kanthi jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ digunakake kanggo ngrangsang sampel ing 540 nm kanthi wektu tundha -10 nganti 7000 ps. Proses set data kaya sing diterangake kanggo Rps. sampel pal.
Membran kasebut di-pellet kanthi sentrifugasi ing 150.000 RCF sajrone 2 jam ing suhu 4°C, banjur absorbansi ing 880 nm disuspensi maneh ing 20 mM tris-HCl (pH 8.0) lan 200 mM NaCl. Larutake membran kanthi ngudhek alon-alon ing 2% (w/v) β-DDM sajrone 1 jam ing peteng ing suhu 4°C. Sampel diencerake ing 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) nganti konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pangolahan luwih lanjut ditindakake saka metode sing diterbitake sadurunge (54), diwiwiti kanthi pengenceran 50 μg protein dadi total 50 μl TEAB sing ngemot 1% (w/v) natrium laurat (Merck, UK). Sawisé sonikasi suwéné 60 detik, direduksi nganggo 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, UK) ing suhu 37°C suwéné 30 menit. Kanggo S-alkilasi, inkubasi sampel nganggo 10 mM metil S-metiltiometanasulfonat (Merck, UK) lan tambahaké saka larutan stok isopropanol 200 mM suwéné 10 menit ing suhu kamar. Pencernaan proteolitik ditindakake kanthi nambahake 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) lan diinkubasi ing suhu 37°C suwéné 3 jam. Surfaktan laurat diekstrak kanthi nambahake 50 μl etil asetat lan 10 μl asam trifluoroasetat kelas LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) lan vortexing suwéné 60 detik. Pamisahan fase dipromosikaké kanthi sentrifugasi ing 15.700 RCF suwéné 5 menit. Miturut protokol pabrikan, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) digunakake kanggo nyedhot lan ngilangake uyah fase ngisor sing ngemot peptida kanthi ati-ati. Sawise dikeringake kanthi sentrifugasi vakum, sampel dilarutake ing 0,5% TFA lan 3% asetonitril, lan 500 ng dianalisis kanthi kromatografi nanoflow RP sing digabungake karo spektrometri massa nggunakake parameter sistem sing dirinci sadurunge.
Gunakna MaxQuant v.1.5.3.30 (56) kanggo identifikasi lan kuantifikasi protein kanggo nggoleki basis data proteome Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri massa wis disimpen ing ProteomeXchange Alliance liwat repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) miturut pengenal set data PXD020402.
Kanggo analisis nganggo RPLC sing digabung karo spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 disiapake saka Rps tipe liar. Nggunakake metode sing diterbitake sadurunge (16), konsentrasi protein sing diasilake ing sel palustris yaiku 2 mg ml-1 ing 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl lan 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad)) DDM. Miturut protokol pabrikan, gunakake kit pemurnian 2D (GE Healthcare, USA) kanggo ngekstrak 10 μg protein kanthi metode presipitasi, lan nglarutake endapan ing 20 μl 60% (v/v) asam format (FA), 20% (v/v) Asetonitril lan 20% (v/v) banyu. Lima mikroliter dianalisis nganggo RPLC (Dionex RSLC) sing digabung karo spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunakna kolom MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) kanggo misahake ing suhu 60°C lan 100μlmin -1, kanthi gradien 85% (v/v) pelarut A [0.1% (v/v) FA lan 0.02% (V/v) larutan TFA] dadi 85%(v/v) pelarut B [0.1%(v/v) FA lan 0.02%(v/v) ing 90%(v/v) asetonitril TFA] Nggunakake sumber ionisasi elektrospray standar lan parameter standar sajrone luwih saka 60 menit, spektrometer massa entuk 100 nganti 2750 m/z (rasio massa-kanggo-muatan). Kanthi bantuan portal sumber daya bioinformatika ExPASy alat FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), peta spektrum massa menyang subunit kompleks kasebut.
Sel-sel kasebut ditumbuhake sajrone 72 jam ing sangisore cahya 100 ml NF-rendah (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) utawa dhuwur (300μMm-2 s-1). Medium M22 (medium M22 ing ngendi amonium sulfat diilangi lan natrium suksinat diganti karo natrium asetat) ing botol sekrup 100 ml (23). Ing limang siklus 30 detik, manik-manik kaca 0,1 mikron dihias kanthi rasio volume 1:1 kanggo lisis sel lan didinginkan ing es sajrone 5 menit. Materi sing ora larut, sel sing ora pecah, lan manik-manik kaca dicopot kanthi sentrifugasi ing 16.000 RCF sajrone 10 menit ing mikrosentrifugasi benchtop. Membran kasebut dipisahake ing rotor Ti 70.1 nganggo 100.000 RCF ing 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kanthi gradien sukrosa 40/15% (w/w) sajrone 10 jam.
Kaya sing diterangake ing karya sadurunge, imunodeteksi tag His ing PufW (16). Cekakipun, kompleks inti sing wis dimurnèkaké (11,8 nM) utawa membran sing ngandhut konsentrasi RC sing padha (ditemtokaké kanthi oksidasi ngurangi spektrum prabédan sing dikurangi lan cocog karo beban ing gel sing diwernani) ing buffer pemuatan SDS 2x (Merck, UK) diencerke kaping pindho. Protein kasebut dipisahake ing gel NuPage bis-tris 12% replika (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel diwernani nganggo Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) kanggo mbukak lan ndeleng subunit RC-L. Protein ing gel kapindho ditransfer menyang membran polivinilidena fluorida (PVDF) sing diaktifake metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) kanggo immunoassay. Membran PVDF diblokir ing 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 lan 5% (w/v) susu bubuk skim, banjur diinkubasi karo antibodi primer anti-His (ing Encerake buffer antibodi [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl lan 0.05% (v/v) Tween-20] ing 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sajrone 4 jam. Sawisé dikumbah kaping 3 suwéné 5 menit ing buffer antibodi, membran kasebut digabung karo antibodi sekunder anti-tikus horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, Inggris) (diencerke 1:10.000 ing buffer antibodi) Inkubasi kanggo ngidini deteksi (5 menit sawisé 3 kali dikumbah ing buffer antibodi) nggunakake substrat chemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) lan Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Inggris).
Kanthi nggambar distribusi intensitas saben gel sing diwernani utawa jalur immunoassay, nggabungake area ing sangisore puncak lan ngetung rasio intensitas RC-L (gel sing diwernani) lan Protein-W (immunoassay), ing ImageJ (57) Proses gambar kasebut. Rasio kasebut diowahi dadi rasio molar kanthi nganggep yen rasio RC-L karo protein-W ing sampel RC-LH114-W murni yaiku 1:1 lan normalisasi kabeh set data miturut kuwi.
Kanggo materi tambahan kanggo artikel iki, mangga deleng http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Iki minangka artikel akses terbuka sing disebarake miturut syarat-syarat Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel iki ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi tanpa watesan ing media apa wae kanthi syarat karya asline dikutip kanthi bener.
Cathetan: Kita mung njaluk sampeyan menehi alamat email supaya wong sing sampeyan rekomendasikake menyang kaca kasebut ngerti yen sampeyan pengin dheweke ndeleng email kasebut lan dudu spam. Kita ora bakal nangkep alamat email apa wae.
Pitakonan iki digunakake kanggo nguji apa sampeyan pengunjung lan nyegah kiriman spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi dhuwur saka kompleks jebakan cahya 1 ing pusat reaksi menehi wawasan anyar babagan dinamika kuinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi dhuwur saka kompleks jebakan cahya 1 ing pusat reaksi menehi wawasan anyar babagan dinamika kuinon.
© 2021 American Association for the Advancement of Science. kabeh hak dilindhungi undhang-undhang. AAAS minangka mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef lan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.