Saiki *Alamat saiki: Cologne 50931, Jerman, Riset Klaster Keunggulan Cologne babagan Respon Stres Seluler ing Penyakit sing gegandhengan karo Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi penyakit mitokondria dianggep ora bisa dibatalake amarga plastisitas metabolik neuron winates, nanging efek disfungsi mitokondria ing otonomi sel metabolisme neuronal ing awak kurang dingerteni. Ing kene, kita ngenalake proteom spesifik sel saka neuron Purkinje kanthi kekurangan OXPHOS progresif sing disebabake dening dinamika fusi mitokondria sing kaganggu. Kita nemokake manawa disfungsi mitokondria micu owah-owahan sing jero ing bidang proteomik, sing pungkasane nyebabake aktivasi sekuensial program metabolisme sing tepat sadurunge pati sel. Tanpa diduga, kita nemtokake induksi piruvat karboksilase (PCx) lan enzim anti-penuaan liyane sing nambahi perantara siklus TCA. Inhibisi PCx nambah stres oksidatif lan neurodegenerasi, sing nuduhake manawa aterosklerosis duwe efek protèktif ing neuron sing ora duwe OXPHOS. Pemulihan fusi mitokondria ing neuron sing degenerasi terminal mbalikke karakteristik metabolisme kasebut, saengga nyegah pati sel. Temuan kita ngenali jalur sing sadurunge ora dingerteni sing menehi ketahanan kanggo disfungsi mitokondria lan nuduhake manawa neurodegenerasi bisa dibatalake sanajan ing tahap pungkasan penyakit kasebut.
Peran utama mitokondria ing njaga metabolisme energi neuronal ditekanake dening gejala neurologis sing ekstensif sing ana gandhengane karo penyakit mitokondria manungsa. Umume penyakit kasebut disebabake dening mutasi gen sing ngatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) utawa karusakan gen sing ana gandhengane karo dinamika mitokondria, sing ora langsung mengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Pakaryan ing model kewan nuduhake yen minangka respon kanggo disfungsi mitokondria ing jaringan sekitar, jalur metabolisme konservatif (5-7) bisa diaktifake, sing nyedhiyakake informasi penting kanggo pangerten sing jero babagan patogenesis penyakit kompleks iki. Kosok baline, pangerten kita babagan owah-owahan metabolisme jinis sel tartamtu sing disebabake dening kegagalan umum produksi adenosin trifosfat mitokondria otak (ATP) minangka dhasar (8), sing nandheske kabutuhan kanggo ngenali target terapeutik sing bisa digunakake kanggo nyegah utawa nyegah penyakit. Nyegah neurodegenerasi (9). Kekurangan informasi yaiku kasunyatan manawa sel saraf dianggep duwe fleksibilitas metabolisme sing winates banget dibandhingake karo jinis sel jaringan sekitar (10). Amarga sel-sel iki nduweni peran penting kanggo koordinasi pasokan metabolit menyang neuron kanggo ningkatake transmisi sinaptik lan nanggapi kondisi cedera lan penyakit, kemampuan kanggo adaptasi metabolisme sel menyang kondisi jaringan otak sing tantangan meh diwatesi mung kanggo sel glial (11-14). Kajaba iku, heterogenitas seluler sing ana ing jaringan otak umume ngalangi panliten babagan owah-owahan metabolisme sing kedadeyan ing subkelompok neuronal tartamtu. Akibate, sithik sing dingerteni babagan akibat seluler lan metabolik sing tepat saka disfungsi mitokondria ing neuron.
Kanggo mangerteni akibat metabolisme saka disfungsi mitokondria, kita ngisolasi neuron Purkinje (PN) ing macem-macem tahapan neurodegenerasi sing disebabake dening karusakan fusi membran njaba mitokondria (Mfn2). Sanajan mutasi Mfn2 ing manungsa ana gandhengane karo sawijining bentuk neuropati sensorik motorik turun temurun sing dikenal minangka Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), karusakan kondisional Mfn2 ing tikus minangka metode disfungsi induksi oksidasi Fosforilasi (OXPHOS) sing wis diakoni kanthi apik. Macem-macem subtipe neuronal (16-19) lan fenotipe neurodegeneratif sing diasilake diiringi gejala neurologis progresif, kayata gangguan gerakan (18, 19) utawa ataksia serebelar (16). Kanthi nggunakake kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, lan metode virologis, kita nuduhake manawa neurodegenerasi progresif banget nyebabake piruvat karboksilase (PCx) lan faktor liyane sing ana gandhengane karo arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Kanggo verifikasi relevansi temuan iki, kita khusus nyuda ekspresi PCx ing PN sing kekurangan Mfn2, lan nemokake manawa operasi iki nambah stres oksidatif lan nyepetake neurodegenerasi, saengga mbuktekake manawa azoospermia menehi adaptasi metabolik kanggo pati sel. Ekspresi MFN2 sing parah bisa nylametake PN degenerasi terminal kanthi kekurangan OXPHOS sing parah, konsumsi DNA mitokondria sing akeh, lan jaringan mitokondria sing rusak, sing luwih nandheske manawa bentuk neurodegenerasi iki malah bisa pulih ing tahap penyakit lanjut sadurunge pati sel.
Kanggo nggambarake mitokondria ing knockout PN Mfn2, kita nggunakake galur tikus sing ngidini mitokondria sing gumantung karo Cre kanggo nargetake ekspresi Cre protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) lan mriksa morfologi mitokondria in vivo. Kita nemokake manawa karusakan gen Mfn2 ing PN bakal nyebabake divisi jaringan mitokondria kanthi bertahap (Gambar S1A), lan owah-owahan paling awal ditemokake ing umur 3 minggu. Kosok baline, degenerasi substansial lapisan sel PN, sing dibuktekake kanthi ilang imunostaining Calbindin, ora diwiwiti nganti umur 12 minggu (Gambar 1, A lan B). Ketidakcocokan wektu antarane owah-owahan paling awal ing morfologi mitokondria lan wiwitan pati neuronal sing katon nyebabake kita nyelidiki owah-owahan metabolisme sing dipicu dening disfungsi mitokondria sadurunge pati sel. Kita ngembangake strategi adhedhasar fluoresensi-activated cell sorting (FACS) kanggo ngisolasi PN sing ngekspresikake YFP (YFP+) (Gambar 1C), lan ing tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), sing sabanjure diarani CTRL (Gambar S1B). Optimalisasi strategi gating adhedhasar intensitas relatif sinyal YFP ngidini kita nyuceni awak YFP+ (YFPhigh) saka PN saka non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) utawa fragmen akson/dendritik fluoresen putatif (YFPlow; Gambar S1D, kiwa), dikonfirmasi dening mikroskop confocal (Gambar S1D, tengen). Kanggo verifikasi identitas populasi sing diklasifikasikake, kita nindakake proteomik LFQ banjur analisis komponen utama, lan nemokake manawa ana pamisahan sing jelas antarane sel YFPhigh lan YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh nuduhake pengayaan bersih saka penanda PN sing dikenal (yaiku Calb1, Pcp2, Grid2 lan Itpr3) (21, 22), nanging ora ana pengayaan protein sing umum diekspresikan ing neuron utawa jinis sel liyane (Gambar 1D)). Perbandingan antarane sampel ing sel YFPhigh sing diklasifikasikake sing diklumpukake ing eksperimen independen nuduhake koefisien korelasi> 0,9, sing nuduhake reproduksibilitas sing apik antarane replikasi biologis (Gambar S1E). Ringkesane, data kasebut mvalidasi rencana kita kanggo isolasi akut lan spesifik saka PN sing layak. Amarga sistem driver L7-cre sing digunakake nyebabake rekombinasi mosaik ing minggu pisanan sawise nglairake (23), kita miwiti nyingkirake tikus saka CTRL lan kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Ngumpulake neuron. Sawise rekombinasi rampung, diarani Mfn2cKO ing umur 4 minggu. Minangka titik pungkasan, kita milih umur 8 minggu nalika lapisan PN isih utuh sanajan ana fragmentasi mitokondria sing jelas (Gambar 1B lan Gambar S1A). Sakabèhé, kita ngetung total 3013 protein, sing kira-kira 22% adhedhasar anotasi MitoCarta 2.0 adhedhasar proteom mitokondria minangka mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial sing ditindakake ing minggu kaping 8 nuduhake yen mung 10,5% saka kabeh protein sing duwe owah-owahan sing signifikan (Gambar 1F lan Gambar S1F), sing 195 protein mudhun lan 120 protein munggah (Gambar 1F). Perlu dicathet yen "analisis jalur inovatif" saka set data iki nuduhake yen gen sing diekspresikan kanthi beda utamane kalebu set jalur metabolisme tartamtu sing diwatesi (Gambar 1G). Menariknya, sanajan downregulation jalur sing ana gandhengane karo OXPHOS lan sinyal kalsium ngonfirmasi induksi disfungsi mitokondria ing PN sing kekurangan fusi, kategori liyane sing utamane nglibatake metabolisme asam amino diregulasi kanthi signifikan, sing selaras karo metabolisme sing kedadeyan ing PN mitokondria. Rewiring konsisten.
(A) Foto confocal representatif saka bagean cerebellar saka tikus CTRL lan Mfn2cKO sing nuduhake mundhut progresif PN (calbindin, abu-abu); inti diwarnai karo DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians siji arah, ***P<0,001; n = 4 nganti 6 bunderan saka telung tikus). (C) Alur kerja eksperimen. (D) Distribusi peta panas penanda khusus kanggo Purkinje (ndhuwur) lan jinis sel liyane (tengah). (E) Diagram Venn sing nuduhake jumlah protein mitokondria sing diidentifikasi ing PN sing diklasifikasikake. (F) Plot gunung geni protein sing diekspresikan kanthi beda ing neuron Mfn2cKO ing 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas nuduhake limang jalur up-regulation (abang) lan down-regulation (biru) sing paling penting ing PN Mfn2cKO sing diklasifikasikake minangka 8 minggu. Tingkat ekspresi rata-rata saben protein sing dideteksi dituduhake. Peta panas skala abu-abu: nilai P sing diatur. ns, ora penting.
Data proteomik nuduhake yen ekspresi protein kompleks I, III, lan IV saya mudhun. Kompleks I, III, lan IV kabeh ngemot subunit sing dikodekake mtDNA sing penting, dene kompleks II, sing mung dikodekake nuklir, ora kena pengaruh (Gambar 2A lan Gambar S2A). . Konsisten karo asil proteomik, imunohistokimia potongan jaringan serebelum nuduhake yen tingkat subunit MTCO1 (subunit oksidase sitokrom C mitokondria 1) saka kompleks IV ing PN saya mudhun (Gambar 2B). Subunit sing dikodekake mtDNA Mtatp8 saya suda sacara signifikan (Gambar S2A), dene tingkat ajeg subunit sintase ATP sing dikodekake nuklir tetep ora owah, sing konsisten karo kompleks F1 subassembly ATP sintase stabil sing dikenal nalika ekspresi mtDNA stabil. Pembentukan kasebut konsisten. Interrupt (7). Evaluasi tingkat mtDNA ing PN Mfn2cKO sing diurutake kanthi reaksi rantai polimerase wektu nyata (qPCR) ngonfirmasi penurunan bertahap ing jumlah salinan mtDNA. Dibandhingake karo klompok kontrol, ing umur 8 minggu, mung udakara 20% saka tingkat mtDNA sing ditahan (Gambar 2C). Konsisten karo asil kasebut, pewarnaan mikroskop confocal saka PN Mfn2cKO digunakake kanggo ndeteksi DNA, sing nuduhake konsumsi nukleotida mitokondria sing gumantung wektu (Gambar 2D). Kita nemokake yen mung sawetara calon sing melu degradasi protein mitokondria lan respon stres sing diatur munggah, kalebu Lonp1, Afg3l2 lan Clpx, lan faktor perakitan kompleks OXPHOS. Ora ana owah-owahan sing signifikan ing tingkat protein sing melu apoptosis sing dideteksi (Gambar S2B). Kajaba iku, kita nemokake yen mitokondria lan saluran retikulum endoplasma sing melu transportasi kalsium mung duwe owah-owahan cilik (Gambar S2C). Kajaba iku, evaluasi protein sing ana gandhengane karo autofagi ora nemokake owah-owahan sing signifikan, sing konsisten karo induksi autofagosom sing katon sing diamati in vivo dening imunohistokimia lan mikroskop elektron (Gambar S3). Nanging, disfungsi OXPHOS progresif ing PN diiringi owah-owahan mitokondria ultrastruktural sing jelas. Kluster mitokondria bisa dideleng ing badan sel lan wit dendritik saka Mfn2cKO PN umur 5 lan 8 minggu, lan struktur membran njero wis ngalami owah-owahan sing jero (Gambar S4, A lan B). Konsisten karo owah-owahan ultrastruktural iki lan penurunan mtDNA sing signifikan, analisis irisan serebelar serebral akut kanthi tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nuduhake yen potensial membran mitokondria ing Mfn2cKO PN mudhun sacara signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis wektu saka tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Mung nimbang protein kanthi P <0,05 ing 8 minggu (ANOVA rong arah). Garis putus-putus: Ora ana penyesuaian dibandhingake karo CTRL. (B) Kiwa: Conto bagean cerebellar sing diwenehi label antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Area sing dikuwasani dening badan sel Purkinje ditutupi kuning. Tengen: Kuantifikasi tingkat MTCO1 (analisis varians siji arah; n = 7 nganti 20 sel sing dianalisis saka telung tikus). (C) Analisis qPCR saka nomer salinan mtDNA ing PN sing diurutake (analisis varians siji arah; n = 3 nganti 7 tikus). (D) Kiwa: Conto irisan cerebellar sing diwenehi label antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Area sing dikuwasani dening badan sel Purkinje ditutupi kuning. Tengen: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians siji arah; n = 5 nganti 9 sel saka telung tikus). (E) Conto saka bagean serebelar akut sing nuduhake sel mitoYFP + Purkinje (panah) ing rekaman klem patch sel kabeh. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rekaman representatif injeksi arus depolarisasi ing sel Purkinje CTRL lan Mfn2cKO. Jejak ndhuwur: Pulsa pisanan sing micu AP. Jejak ngisor: Frekuensi AP maksimum. (H) Kuantifikasi input spontan postsinaptik (sPSP). Jejak rekaman representatif lan rasio zoom dituduhake ing (I). Analisis varian siji arah dianalisis n = 5 nganti 20 sel saka telung tikus. Data dinyatakake minangka rata-rata ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Jejak representatif AP spontan sing direkam nggunakake mode klem patch perforasi. Jejak ndhuwur: Frekuensi AP maksimum. Jejak ngisor: zoom saka siji AP. (K) Kuantifikasi frekuensi AP rata-rata lan maksimum miturut (J). Tes Mann-Whitney; n = 5 sel dianalisis saka papat tikus. Data ditulis minangka rata-rata ± SEM; ora penting.
Karusakan OXPHOS sing jelas dideteksi ing PN Mfn2cKO umur 8 minggu, sing nuduhake yen fungsi fisiologis neuron ora normal banget. Mulane, kita nganalisa karakteristik listrik pasif neuron sing kekurangan OXPHOS ing 4 nganti 5 minggu lan 7 nganti 8 minggu kanthi nindakake rekaman klem patch sel utuh ing irisan cerebellar akut (Gambar 2E). Tanpa diduga, potensial membran istirahat rata-rata lan resistensi input neuron Mfn2cKO padha karo kontrol, sanajan ana bedane sing alus antarane sel (Tabel 1). Kajaba iku, ing umur 4 nganti 5 minggu, ora ana owah-owahan sing signifikan ing hubungan arus-voltase (kurva IV) sing ditemokake (Gambar 2F). Nanging, ora ana neuron Mfn2cKO umur 7 nganti 8 minggu sing slamet saka regimen IV (langkah hiperpolarisasi), sing nuduhake yen ana sensitivitas sing jelas kanggo potensial hiperpolarisasi ing tahap pungkasan iki. Kosok baline, ing neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi sing nyebabake pelepasan potensial aksi (AP) sing bola-bali ditoleransi kanthi apik, nuduhake yen pola pelepasan sakabèhé ora beda banget karo neuron kontrol umur 8 minggu (Tabel 1 lan Gambar 2G). Kajaba iku, frekuensi lan amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) bisa dibandhingake karo klompok kontrol, lan frekuensi kedadeyan mundhak saka 4 minggu nganti 5 minggu nganti 7 minggu nganti 8 minggu kanthi kenaikan sing padha (Gambar 2, H lan I). Periode pematangan sinaptik ing PN (25). Asil sing padha dipikolehi sawise tambalan PN sing dilubangi. Konfigurasi iki nyegah kemungkinan kompensasi cacat ATP seluler, kaya sing bisa kedadeyan ing rekaman klem tambalan sel utuh. Utamane, potensial membran istirahat lan frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO ora kena pengaruh (Gambar 2, J lan K). Ringkesane, asil iki nuduhake yen PN kanthi disfungsi OXPHOS sing jelas bisa ngatasi pola debit frekuensi dhuwur kanthi apik, nuduhake yen ana mekanisme kompensasi sing ngidini dheweke njaga respon elektrofisiologis sing meh normal.
Data kasebut ditulis minangka rata-rata ± SEM (analisis varians siji arah, uji perbandingan ganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomer unit dituduhake nganggo kurung.
Kita miwiti nyelidiki apa ana kategori ing set data proteomik (Gambar 1G) sing kalebu jalur sing bisa nglawan kekurangan OXPHOS sing parah, saengga nerangake kenapa PN sing kena pengaruh bisa njaga elektrofisiologi sing meh normal (Gambar 2, E nganti K). Analisis proteomik nuduhake yen enzim sing melu katabolisme asam amino rantai cabang (BCAA) diatur kanthi signifikan (Gambar 3A lan Gambar S5A), lan produk pungkasan asetil-CoA (CoA) utawa suksinil CoA bisa nambah trikarboksilat ing siklus Asam arteriosklerosis (TCA). Kita nemokake yen isi BCAA transaminase 1 (BCAT1) lan BCAT2 loro-lorone tambah. Dheweke ngatalisis langkah pertama katabolisme BCAA kanthi ngasilake glutamat saka α-ketoglutarat (26). Kabeh subunit sing mbentuk kompleks dehidrogenase asam keto rantai cabang (BCKD) diregulasi (kompleks kasebut ngatalisis dekarboksilasi sabanjure lan ora bisa dibatalake saka kerangka karbon BCAA sing diasilake) (Gambar 3A lan Gambar S5A). Nanging, ora ana owah-owahan sing jelas ing BCAA dhewe sing ditemokake ing PN sing diurutake, sing bisa uga amarga tambah akeh serapan seluler asam amino penting iki utawa panggunaan sumber liyane (glukosa utawa asam laktat) kanggo nambah siklus TCA (Gambar S5B). PN sing ora duwe OXPHOS uga nuduhake tambah akeh aktivitas dekomposisi glutamin lan transaminasi ing umur 8 minggu, sing bisa dicerminkan dening tambah akeh enzim mitokondria glutaminase (GLS) lan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A lan C). Perlu dicathet yen peningkatan GLS diwatesi mung ing isoform glutaminase C sing disambung (GLS-GAC) (owah-owahan Mfn2cKO/CTRL kira-kira 4,5 kali lipat, P = 0,05), lan peningkatan spesifik ing jaringan kanker bisa ndhukung bioenergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas nuduhake owah-owahan lipatan ing tingkat protein kanggo rute sing ditemtokake ing 8 minggu. (B) Conto irisan cerebellar sing diwenehi label antibodi anti-PCx (bar skala, 20 μm). Panah kuning nuduhake awak sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein kursus wektu sing diidentifikasi minangka kandidat penting kanggo aterosklerosis (uji-t ganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Ndhuwur: Diagram skematis sing nuduhake macem-macem cara ngetik karbon sing diwenehi label sing ana ing pelacak piruvat [1-13C] (yaiku, liwat PDH utawa rute trans-arteri). Ngisor: Grafik biola nuduhake persentase karbon sing diwenehi label tunggal (M1) sing diowahi dadi asam aspartat, asam sitrat lan asam malat sawise menehi label irisan cerebellar akut nganggo [1-13C]piruvat (uji-t dipasangake; ** P <0,01). (E) Analisis riwayat wektu sing komprehensif saka jalur sing dituduhake. Mung nimbang protein kanthi P<0,05 ing 8 minggu. Garis putus-putus: ora ana nilai pangaturan (analisis varians rong arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data ditulis minangka rata-rata ± SEM.
Ing analisis kita, katabolisme BCAA wis dadi salah sawijining jalur up-regulation utama. Kasunyatan iki nuduhake kanthi kuat yen volume ventilasi sing mlebu siklus TCA bisa uga diganti ing PN sing kurang OXPHOS. Iki bisa uga minangka wujud utama saka rewiring metabolik neuronal, sing bisa uga duwe pengaruh langsung marang fisiologi neuronal lan kaslametan sajrone njaga disfungsi OXPHOS sing parah. Konsisten karo hipotesis iki, kita nemokake yen enzim anti-aterosklerotik utama PCx diatur munggah (Mfn2cKO/CTRL owah kira-kira 1,5 kali; Gambar 3A), sing ngatalisis konversi piruvat dadi oksaloasetat (28), sing diyakini ana ing jaringan otak. Ekspresi ing diwatesi mung kanggo astrosit (29, 30). Konsisten karo asil proteomik, mikroskop confocal nuduhake yen ekspresi PCx tambah khusus lan signifikan ing PN sing kurang OXPHOS, dene reaktivitas PCx utamane diwatesi ing sel glial Bergmann sing cedhak karo kontrol (Gambar 3B). Kanggo nguji kanthi fungsional upregulasi PCx sing diamati, kita nambani irisan cerebellar akut nganggo pelacak [1-13C]piruvat. Nalika piruvat dioksidasi dening piruvat dehidrogenase (PDH), label isotop ilang, Nanging digabungake menyang intermediet siklus TCA nalika piruvat dimetabolisme dening reaksi vaskular (Gambar 3D). Kanggo ndhukung data proteomik kita, kita mirsani akeh penanda saka pelacak iki ing asam aspartat saka irisan Mfn2cKO, dene asam sitrat lan asam malat uga duwe tren moderat, sanajan ora signifikan (Gambar 3D).
Ing neuron dopamin tikus MitoPark kanthi disfungsi mitokondria sing disebabake dening neuron dopamin sing khusus ngrusak gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx uga mundhak sacara signifikan (31), nuduhake yen arteriosklerosis asam aseton. Kedadeyan penyakit kasebut diatur sajrone disfungsi OXPHOS neuronal ing awak. Perlu dicathet yen wis ditemokake yen enzim unik (32-34) sing bisa diekspresikan ing neuron sing bisa uga ana gandhengane karo arteriosklerosis mundhak sacara signifikan ing PN sing kurang OXPHOS, kayata propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonyl-CoA ngowahi propionil-CoA dadi suksinil-CoA lan enzim malat mitokondria 3 (ME3), sing peran utamane yaiku mbalekake piruvat saka malat (Gambar 3, A lan C) (33, 35). Kajaba iku, kita nemokake peningkatan sing signifikan ing enzim Pdk3, sing ngfosforilasi lan kanthi mangkono nginaktivasi PDH (36), dene ora ana owah-owahan sing dideteksi ing enzim Pdp1 sing ngaktifake PDH utawa kompleks enzim PDH dhewe (Gambar 3A). Sacara konsisten, ing Mern2cKO PN, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) subunit saka komponen piruvat dehidrogenase E1 saka kompleks PDH ing Ser293 (sing dikenal nyegah aktivitas enzim PDH) saya tambah (Gambar S6C) (Gambar S6C). Piruvat ora duwe akses vaskular.
Pungkasan, kita nemokake manawa jalur super biosintesis serin lan glisin, siklus folat mitokondria (1C) sing ana gandhengane lan biosintesis prolin (Gambar 1G lan Gambar S5C) kabeh diatur kanthi signifikan, miturut laporan, sajrone proses aktivasi. Jaringan sekitar diaktifake kanthi disfungsi mitokondria (5-7). Analisis confocal sing ndhukung data proteomik iki nuduhake manawa ing PN kanthi OXPHOS sing ilang, irisan cerebellar tikus umur 8 minggu diwenehi serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun sing signifikan (Gambar S5D). Ing 13 irisan cerebellar akut sing diinkubasi CU-glukosa, eksperimen pelacakan metabolik luwih ngonfirmasi peningkatan biosintesis serin lan prolin, sing nuduhake manawa fluks isoform karbon dadi serin lan prolin tambah (Gambar S5E). Amarga reaksi sing dipromosikake dening GLS lan GPT2 tanggung jawab kanggo sintesis glutamat saka glutamin lan transaminasi antarane glutamat lan α-ketoglutarat, upregulasi kasebut nuduhake yen neuron sing kekurangan OXPHOS duwe panjaluk glutamat sing tambah akeh, Iki bisa uga ditujokake kanggo njaga biosintesis prolin sing tambah akeh (Gambar S5C). Beda karo owah-owahan kasebut, analisis proteomik astrosit serebelar saka tikus Mfn2cKO spesifik PN nuduhake yen jalur kasebut (kalebu kabeh antiperoksidase) ora owah sacara signifikan ing ekspresi, saengga nuduhake Pengalihan metabolik iki selektif kanggo PN sing rusak (Gambar S6, D nganti G).
Ringkesane, analisis iki nuduhake pola aktivasi temporal jalur metabolisme tartamtu ing PN sing beda banget. Sanajan fungsi mitokondria neuronal sing ora normal bisa nyebabake aterosklerosis awal lan remodeling 1C (Gambar 3E lan Gambar S5C), lan malah owah-owahan sing bisa diprediksi ing ekspresi kompleks I lan IV, owah-owahan ing sintesis serin de novo mung katon ing tahap pungkasan. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E lan Gambar S5C). Temuan iki nemtokake proses sekuensial ing ngendi mitokondria (siklus 1C) lan sitoplasma (biosintesis serin) sing diinduksi stres nanggepi kanthi sinergis karo peningkatan aterosklerosis ing siklus TCA kanggo mbentuk maneh metabolisme neuronal.
PN sing kekurangan OXPHOS umur 8 minggu bisa njaga aktivitas eksitasi frekuensi dhuwur lan ngalami penyambungan maneh metabolisme sing signifikan kanggo ngimbangi disfungsi mitokondria. Panemon iki ngungkit kemungkinan sing menarik yen sanajan ing wektu iki, sel-sel kasebut uga bisa nampa intervensi terapeutik kanggo nundha utawa nyegah neurodegenerasi. Kasep. Kita ngrampungake kemungkinan iki liwat rong intervensi independen. Ing metode pertama, kita ngrancang vektor virus sing ana gandhengane karo adeno (AAV) sing gumantung karo Cre supaya MFN2 bisa diekspresikan kanthi selektif ing PN sing kekurangan OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV sing ngode MFN2 lan gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi ing kultur neuron primer in vitro, sing nyebabake MFN2 diekspresikan kanthi cara sing gumantung karo Cre lan nylametake morfologi mitokondria, saengga nyegah neuromutasi ing neuron Mfn2cKO (Gambar S7, B, D lan E). Sabanjure, kita nindakake eksperimen in vivo kanggo ngirim Mfn2-AAV umur 8 minggu kanthi stereotaktik menyang korteks serebelar tikus Mfn2cKO lan kontrol, lan nganalisa tikus umur 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO sing diobati mati (Gambar 1, A lan B) (16). Transduksi virus in vivo nyebabake ekspresi selektif PN ing sawetara bunderan serebelar (Gambar S7, G lan H). Injeksi AAV kontrol sing mung ngekspresikake mCherry (Ctrl-AAV) ora duwe efek sing signifikan marang tingkat neurodegenerasi ing kewan Mfn2cKO. Kosok baline, analisis Mfn2cKO sing ditransduksi karo Mfn2-AAV nuduhake efek protèktif sing signifikan saka lapisan sel PN (Gambar 4, B lan C). Utamane, kapadhetan neuron meh ora bisa dibedakake saka kewan kontrol (Gambar 4, B lan C, lan Gambar S7, H lan I). Ekspresi MFN1 nanging ora MFN2 uga efektif kanggo nylametake pati neuronal (Gambar 4C lan Gambar S7, C lan F), sing nuduhake yen ekspresi MFN1 ektopik bisa kanthi efektif nambahi kekurangan MFN2. Analisis luwih lanjut ing tingkat PN tunggal nuduhake yen Mfn2-AAV sebagian besar nylametake ultrastruktur mitokondria, normalake tingkat mtDNA, lan mbalikke ekspresi dhuwur saka penanda anti-angiogenesis PCx ​​(Gambar 4, C nganti E). Inspeksi visual tikus Mfn2cKO sing dislametake ing kahanan istirahat nuduhake yen postur lan gejala motorik (gerakan S1 nganti S3) saya apik. Kesimpulane, eksperimen kasebut nuduhake yen introduksi maneh MFN2 sing ditundha menyang PN sing kekurangan OXPHOS cukup kanggo mbalikke konsumsi mtDNA lan nyebabake aterosklerosis, saengga nyegah degenerasi akson lan pati neuronal in vivo.
(A) Skema sing nuduhake jadwal eksperimen kanggo nyuntikake AAV sing ngode MFN2 nalika jalur metabolisme sing dituduhake diaktifake. (B) Gambar confocal representatif saka irisan cerebellar umur 12 minggu sing ditransduksi ing 8 minggu ing tikus Mfn2cKO lan diwenehi label antibodi anti-Calbindin. Tengen: Penskalaan serat akson. Skala zoom akson yaiku 450 lan 75 μm. (C) Kiwa: Kuantifikasi kapadhetan sel Purkinje ing loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians siji arah; n = 3 tikus). Tengen: analisis fokus mtDNA ing PN sing ditransduksi ing minggu 12 (uji-t sing ora dipasangake; n = 6 sel saka telung tikus). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf elektron transmisi representatif saka PN saka bagean cerebellar Mfn2cKO sing ditransduksi karo vektor virus sing dituduhake. Topeng jambon nggambarake area sing dikuwasani dendrit, lan kothak titik-titik kuning nggambarake zoom sing diwenehake ing sisih tengen; n makili inti. Bilah skala, 1μm. (E) nuduhake conto pewarnaan PCx ing PN sing ditransduksi ing 12 minggu. Bilah skala, 20μm. OE, overekspresi; FC, owah-owahan lipatan.
Pungkasan, kita nyelidiki pentinge kaslametané sèl sing diinduksi peroksidase ing PN sing wis ngalami disfungsi OXPHOS. Kita ngasilake mCherry sing ngode AAV-shRNA (RNA jepit rambut cendhak) khusus nargetake mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), lan nyuntikake virus utawa kontrol acak (AAV-scr) menyang cerebellum tikus Mfn2cKO. Injeksi kasebut ditindakake ing minggu kaping papat (Gambar 5A) kanggo entuk knockdown PCx sing efektif sajrone periode nalika ekspresi PCx mundhak (Gambar 3C) lan lapisan sel PN isih utuh (Gambar 1A). Perlu dicathet yen knockdown PCx (Gambar S8A) nyebabake akselerasi pati PN sing signifikan, sing diwatesi ing cincin sing kena infeksi (Gambar 5, B lan C). Kanggo mangerteni mekanisme efek metabolisme sing disebabake dening peningkatan regulasi PCx, kita nyinaoni status redoks PN sawise knockdown PCx lan biosensor optik sing dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan kanthi bebarengan (Gambar S8, B nganti D) kanggo ngevaluasi glutathione. Owah-owahan relatif potensial redoks peptida (38). Banjur, kita nindakake mikroskop pencitraan seumur hidup fluoresensi rong foton (FLIM) ing irisan otak akut Mfn2cKO umur 7 minggu utawa pasangan kontrol kanggo ndeteksi owah-owahan potensial ing status redoks sitoplasma sawise verifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E nganti G). Analisis kasebut nuduhake peningkatan sing signifikan ing status oksidasi saka PN Mfn2cKO tunggal sing ora duwe ekspresi PCx, sing beda karo neuron kontrol utawa PN Mfn2cKO sing mung ngekspresikan shRNA acak (Gambar 5, D lan E). Nalika ekspresi PCx mudhun, persentase Mfn2cKO PN sing nuduhake kahanan teroksidasi banget mundhak luwih saka kaping telu (Gambar 5E), sing nuduhake yen peningkatan regulasi PCx njaga kapasitas redoks neuron sing degenerasi.
(A) Skema sing nuduhake jadwal eksperimen kanggo nyuntikake AAV sing ngode shPCx nalika jalur metabolisme sing dituduhake diaktifake. (B) Foto confocal representatif saka bagean serebelum umur 8 minggu ing tikus Mfn2cKO sing ditransduksi lan diwenehi label antibodi anti-kalsineurin ing 4 minggu. Bar skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kapadhetan sel Purkinje ing loop sing ditransduksi AAV (analisis varians siji arah; n = 3 nganti 4 tikus). Data dinyatakake minangka rata-rata ± SEM; ***P <0,001. (D) Gambar FLIM representatif nuduhake umur rata-rata PN umur 7 minggu sing ngekspresikan sensor glutathione redoks Grx1-roGFP2 ing kahanan eksperimen sing ditemtokake. Rasio LUT (tabel tampilan): interval wektu kaslametan (ing pikodetik). Bar skala, 25μm. (E) Histogram nuduhake distribusi nilai umur Grx1-roGFP2 saka (D) (n=158 nganti 368 sel ing rong tikus miturut saben kondisi). Grafik bunder ing ndhuwur saben histogram: nuduhake jumlah sel kanthi nilai umur sing luwih dawa (abang, teroksidasi) utawa luwih cendhek (biru, suda) sing luwih dawa, sing ngluwihi 1 SD saka nilai umur rata-rata ing CTRL-AAV-scr. (F) Model sing diusulake nuduhake efek protèktif saka upregulasi PCx neuronal.
Sakabèhé, data sing diwènèhaké ing kéné nuduhaké yèn èksprési manèh MFN2 bisa nylametaké PN lanjut kanthi kekurangan OXPHOS sing parah, penipisan mtDNA sing parah, lan morfologi kaya ista sing ora normal banget, saéngga nyedhiyakaké kemajuan sing terus-terusan sanajan ing penyakit lanjut. Neurodegenerasi nyedhiyakaké bukti sing bisa dibalikaké saka tahap sadurungé pati sèl. Tingkat fleksibilitas metabolik iki luwih ditekanaké déning kemampuan neuron kanggo ngindhuksi aterosklerosis (penyusunan ulang siklus TCA), sing ngalangi èksprési PCx ing PN sing ora duwé OXPHOS lan nambah pati sèl, saéngga nduwèni peran protèktif (Gambar 5F).
Ing panliten iki, kita menehi bukti yen respon PN marang disfungsi OXPHOS yaiku kanthi bertahap konvergen menyang aterosklerosis siklus TCA liwat jalur aktivasi diferensial sing diaktifake dening program metabolisme. Kita ngonfirmasi analisis proteomik kanthi akeh metode komplementer lan nuduhake yen nalika ditantang dening disfungsi mitokondria sing parah, neuron duwe bentuk elastisitas metabolik sing sadurunge ora dingerteni. Sing nggumunake, kabeh proses rewiring ora mesthi nandhani kahanan metabolisme terminal sing ngancani neurodegenerasi kanthi bertahap lan ora bisa dibatalake, nanging data kita nuduhake yen bisa uga dadi neuron pangopènan sanajan ing tahap sadurunge pati sel Mekanisme kompensasi fungsional. Temuan iki nuduhake yen neuron duwe tingkat plastisitas metabolik sing cukup gedhe ing awak. Kasunyatan iki mbuktekake yen introduksi maneh MFN2 mengko bisa mbalikke ekspresi penanda metabolik utama lan nyegah degenerasi PN. Kosok baline, nyegah aterosklerosis lan nyepetake saraf. transeksual.
Salah sawijining temuan sing paling narik kawigaten ing riset kita yaiku PN sing ora duwe OXPHOS bisa ngowahi metabolisme siklus TCA kanthi ningkatake enzim sing khusus ngrangsang arteriosklerosis. Penyusunan ulang metabolik minangka fitur umum sel kanker, sawetara gumantung marang glutamin kanggo nambahi intermediet siklus TCA kanggo ngasilake padanan pangurang, sing ndorong rantai pernapasan lan njaga produksi prekursor biosintesis lipid lan nukleotida (39, 40). Panaliten anyar nuduhake yen ing jaringan perifer sing ngalami disfungsi OXPHOS, sambungan maneh metabolisme glutamin/glutamat uga minangka fitur sing penting (5, 41), ing ngendi arah mlebune glutamin menyang siklus TCA gumantung marang Amarga keruwetan cedera OXPHOS (41). Nanging, ora ana bukti sing jelas babagan kamiripan plastisitas metabolik neuronal ing awak lan kemungkinan relevansi ing konteks penyakit. Ing panliten in vitro anyar, neuron kortikal utama dituduhake kanggo nggerakake blumbang glutamat kanggo neurotransmisi, saengga ningkatake metabolisme oksidatif lan aterosklerosis ing kahanan stres metabolik (42). Perlu dicathet yen ing sangisore inhibisi farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipercaya bisa njaga sintesis oksaloasetat ing neuron granul serebelum sing dikultur (34). Nanging, relevansi fisiologis mekanisme kasebut kanggo jaringan otak (ing ngendi aterosklerosis dipercaya utamane diwatesi ing astrosit) isih nduweni makna fisiologis sing penting (43). Ing kasus iki, data kita nuduhake yen PN sing rusak dening OXPHOS ing awak bisa diganti dadi degradasi BCAA lan karboksilasi piruvat, sing minangka rong sumber utama suplementasi intermediet kolam TCA. Sanajan kontribusi putatif katabolisme BCAA kanggo metabolisme energi neuronal wis diusulake, saliyane peran glutamat lan GABA kanggo neurotransmisi (44), isih durung ana bukti kanggo mekanisme kasebut in vivo. Mulane, gampang kanggo berspekulasi yen PN sing ora berfungsi bisa kanthi otomatis ngimbangi konsumsi intermediet TCA sing didorong dening proses asimilasi kanthi nambah aterosklerosis. Utamane, peningkatan regulasi PCx bisa uga dibutuhake kanggo njaga peningkatan permintaan asam aspartat, sing disaranake ing sel sing berkembang biak kanthi disfungsi mitokondria (45). Nanging, analisis metabolomik kita ora nuduhake owah-owahan sing signifikan ing tingkat asam aspartat sing stabil ing Mfn2cKO PN (Gambar S6A), sing mestine nggambarake panggunaan metabolisme asam aspartat sing beda antarane sel sing berkembang biak lan neuron pasca-mitosis. Sanajan mekanisme sing tepat saka peningkatan regulasi PCx ing neuron disfungsional in vivo isih kudu dideskripsikake, kita nduduhake manawa respon prematur iki nduweni peran penting kanggo njaga kahanan redoks neuron, sing dituduhake ing eksperimen FLIM ing irisan cerebellar. Utamane, nyegah PN saka peningkatan regulasi PCx bisa nyebabake kahanan sing luwih teroksidasi lan nyepetake pati sel. Aktivasi degradasi BCAA lan karboksilasi piruvat dudu cara kanggo menehi ciri jaringan perifer disfungsi mitokondria (7). Mulane, dheweke katon minangka fitur prioritas neuron sing kekurangan OXPHOS, sanajan dudu siji-sijine fitur, sing penting kanggo neurodegenerasi. .
Penyakit serebelar minangka jinis penyakit neurodegeneratif heterogen sing biasane katon minangka ataksia lan asring ngrusak PN (46). Populasi neuron iki rentan banget marang disfungsi mitokondria amarga degenerasi selektif ing tikus cukup kanggo ngasilake akeh gejala motorik sing dadi ciri ataksia spinocerebelar manungsa (16, 47, 48). Miturut laporan, model tikus transgenik kanthi gen mutan digandhengake karo ataksia spinocerebelar manungsa lan duwe disfungsi mitokondria (49, 50), sing nandheske pentinge nyinaoni akibat saka kekurangan OXPHOS ing PNPH. Mulane, cocog banget kanggo ngisolasi lan nyinaoni populasi neuron unik iki kanthi efektif. Nanging, amarga PN sensitif banget marang tekanan lan nyumbang proporsi sing sithik saka kabeh populasi sel serebelar, kanggo akeh panliten adhedhasar omics, pamisahan selektif minangka sel utuh isih dadi aspek sing tantangan. Sanajan meh ora mungkin kanggo entuk kekurangan kontaminasi mutlak saka jinis sel liyane (utamane jaringan diwasa), kita nggabungake langkah disosiasi sing efektif karo FACS kanggo entuk jumlah neuron sing cukup kanggo analisis proteomik hilir, lan duwe jangkoan protein sing cukup dhuwur (udakara 3000 protein) dibandhingake karo set data sing ana saka kabeh cerebellum (51). Kanthi njaga kelangsungan urip kabeh sel, metode sing diwenehake ing kene ngidini kita ora mung mriksa owah-owahan ing jalur metabolisme ing mitokondria, nanging uga mriksa owah-owahan ing pasangan sitoplasma, sing nglengkapi panggunaan tag membran mitokondria kanggo ngayakake jinis sel. Metode anyar kanggo jumlah mitokondria ing jaringan kompleks (52, 53). Metode sing diterangake ora mung ana gandhengane karo panliten sel Purkinje, nanging bisa diterapake kanthi gampang ing sembarang jinis sel kanggo ngatasi owah-owahan metabolisme ing otak sing lara, kalebu model disfungsi mitokondria liyane.
Pungkasanipun, kita sampun ngidentifikasi jendela terapeutik sajrone proses penyusunan ulang metabolisme iki sing saged mbalikke tandha-tandha kunci stres seluler lan nyegah degenerasi neuron. Mulane, mangerteni implikasi fungsional saka rewiring sing diterangake ing kene bisa menehi wawasan dhasar babagan perawatan sing bisa ditindakake kanggo njaga kelangsungan urip neuron sajrone disfungsi mitokondria. Riset ing mangsa ngarep sing ngarahake kanggo mbedah owah-owahan metabolisme energi ing jinis sel otak liyane dibutuhake kanggo mbukak kanthi lengkap penerapan prinsip iki kanggo penyakit neurologis liyane.
Tikus MitoPark wis diterangake sadurunge (31). Tikus C57BL/6N kanthi gen Mfn2 sing ngapit loxP wis diterangake sadurunge (18) lan disilangkan karo tikus L7-Cre (23). Turunan heterozigot dobel sing diasilake banjur disilangkan karo tikus Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot kanggo ngasilake knockout gen spesifik Purkinje kanggo Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ing subkumpulan kawin, alel SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) dikenalake liwat persilangan tambahan (20). Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman Eropa, nasional lan kelembagaan lan disetujoni dening LandesamtfürNatur saka Umwelt lan Verbraucherschutz, Rhine-Westphalia Utara, Jerman. Pakaryan kewan uga ngetutake pandhuan saka Federasi Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium Eropa.
Sawisé dibius dislokasi serviks wanita ngandhut, embrio tikus diisolasi (E13). Korteks dibedah ing Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) sing ditambah 10 mM Hepes lan diwènèhaké Medium Dulbecco's Modified Eagle's sing ngandhut papain (20 U/ml) lan sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan ing DMEM) lan pisahaké kanthi pencernaan enzimatik. Ml) ing suhu 37°C suwéné 20 menit, banjur digiling sacara mekanis ing DMEM sing ditambah 10% serum janin sapi. Sel-sel kasebut disebar ing kaca penutup sing dilapisi polilisin kanthi kapadhetan 2×106 saben piring kultur 6 cm utawa kanthi kapadhetan 0,5×105 sel/cm2 kanggo analisis pencitraan. Sawisé 4 jam, medium kasebut diganti karo medium bebas serum Neurobasal sing ngandhut suplemen B27 1% lan 0,5 mM GlutaMax. Neuron-neuron kasebut banjur dijaga ing suhu 37°C lan 5% CO2 sajrone eksperimen, lan diwenehi panganan seminggu sepisan. Kanggo ngindhuksi rekombinasi in vitro, 3μl (cawan kultur 24-sumur) utawa 0,5μl (cawan 24-sumur) saka vektor virus AAV9 ing ngisor iki digunakake kanggo nambani neuron ing dina kapindho in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomer katalog 105530-AAV9) lan AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomer katalog 105545-AAV9).
DNA komplementer Mouse Mfn1 lan Mfn2 (dipikolehi saka plasmid Addgene #23212 lan #23213) ditandhani nganggo urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) ing C-terminus, lan digabung karo mCherry ing pigura liwat urutan T2A. Grx1-roGFP2 minangka hadiah saka Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Kanthi ngganti kaset tdTomato nggunakake metode kloning konvensional, kaset kasebut disubklon menyang tulang punggung pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomer referensi Addgene 28306) kanggo ngasilake vektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 lan pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi sing padha digunakake kanggo ngasilake vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Kanggo ngasilake konstruksi AAV-shPCx, vektor plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) dibutuhake, sing ngemot urutan DNA sing ngode PCx tikus target shRNA (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Ing sangisore kontrol promotor U6, mCherry digunakake ing sangisore kontrol promotor CMV. Produksi vektor AAV tambahan ditindakake miturut pandhuan pabrikan (Cell Biolabs). Cekakipun, gunakake plasmid transfer sing nggawa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Transfeksi sementara gen pengkode 293AAV sel-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) utawa Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), uga pengkode protein kapsid AAV1 lan protein aksesori. Plasmid plasmid kemasan, nggunakake metode kalsium fosfat. Supernatan virus mentah dipikolehi kanthi siklus beku-cair ing bak es/etanol garing lan sel sing dilisis ing larutan garam fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnèkaké nganggo ultrasentrifugasi gradien iodixanol sing ora terus-terusan (24 jam ing 32.000 rpm lan 4°C) lan dikonsentrasikaké nganggo filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX kaya sing wis dijlèntrèhaké sadurungé (54), diukur nganggo PCR kuantitatif wektu nyata (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) lan AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Neuron primer dikerok ing 1x PBS sing adhem banget, di-pellet, banjur dihomogenisasi ing 0,5% Triton X-100 / 0,5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer sing ngemot fosfatase lan protease inhibitor (Roche). Kuantifikasi protein ditindakake kanthi nggunakake uji asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protein kasebut banjur dipisahake kanthi elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, banjur di-blot ing membran polivinilidena fluorida (GE Healthcare). Blokir situs non-spesifik lan inkubasi nganggo antibodi primer (waca Tabel S1 kanggo rincian) ing susu 5% ing TBST (Tris-buffered saline karo Tween), langkah pencucian lan antibodi sekunder ing TBST Incubate. Inkubasi nganggo antibodi primer sewengi ing suhu +4°C. Sawise dicuci, olesake antibodi sekunder sajrone 2 jam ing suhu kamar. Sabanjure, kanthi inkubasi blot sing padha karo antibodi anti-β-aktin, pemuatan sing padha dikonfirmasi. Deteksi kanthi ngowahi dadi kemiluminesensi lan ningkatake kemiluminesensi (GE Healthcare).
Neuron sing sadurunge diumbi ing kaca penutup difiksasi nganggo 4% paraformaldehida (PFA)/PBS ing titik wektu sing ditemtokake ing suhu kamar suwene 10 menit. Penutup pisanan diresap nganggo 0,1% Triton X-100/PBS suwene 5 menit ing suhu kamar, banjur ing buffer pemblokiran [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Ing dina kapindho, penutup dicuci nganggo buffer pemblokiran lan diinkubasi nganggo antibodi sekunder konjugasi fluorofor sing cocog suwene 2 jam ing suhu kamar; pungkasane, sampel dicuci kanthi tliti ing PBS nganggo 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) sing diwarnai lan banjur difiksasi ing slide mikroskop nganggo Aqua-Poly/Mount.
Tikus (lanang lan wadon) dibius nganggo injeksi intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) lan xylazine (10 mg/kg) lan diwenehake kanthi subkutan nganggo analgesik carprofen (5 mg/kg). Banjur dilebokake ing instrumen stereotaktik (Kopf) sing dilengkapi bantalan anget. Bukak tengkorak lan gunakake bor gigi kanggo ngencerake bagean korteks serebelum sing cocog karo balung mis (saka lambda: buntut 1.8, lateral 1, sing cocog karo lobulus IV lan V). Gunakake jarum suntik sing mlengkung kanggo nggawe bolongan cilik ing tengkorak kanthi ati-ati supaya ora ngganggu pembuluh darah ing ngisor. Banjur kapiler kaca tipis sing ditarik dilebokake alon-alon menyang bolongan mikro (saka -1.3 nganti -1 ing sisih ventral dura mater), lan 200 nganti 300 nl AAV disuntikake menyang mikro-injektor (Narishige) nganggo jarum suntik manual (Narishige) kaping pirang-pirang kanthi tekanan rendah sajrone periode wektu 10 nganti 20 menit. Sawisé infus, pasang kapiler sajrone 10 menit manèh supaya virus nyebar kanthi sampurna. Sawisé kapiler dicopot, kulit dijahit kanthi ati-ati kanggo nyuda inflamasi tatu lan ngidini kéwan kasebut pulih. Kéwan-kéwan kasebut diobati nganggo analgesik (caspofen) sajrone sawetara dina sawisé operasi, sajrone wektu kasebut kondisi fisik dipantau kanthi ati-ati lan banjur di-eutanasia ing wektu sing wis ditemtokake. Kabeh prosedur ditindakake miturut pedoman Eropa, nasional, lan kelembagaan lan disetujoni déning LandesamtfürNatur saka Umwelt lan Verbraucherschutz, Rhine-Westphalia Lor, Jerman.
Kewan-kewan kasebut dibius nganggo ketamin (100 mg/kg) lan xylazine (10 mg/kg), lan jantung diperfusi nganggo 0,1 M PBS dhisik, banjur nganggo 4% PFA ing PBS. Jaringan kasebut dibedah lan difiksasi ing 4% PFA/PBS sewengi ing suhu 4°C. Pisau geter (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) digunakake kanggo nyiyapake bagean sagital (tebal 50 μm) saka otak sing difiksasi ing PBS. Kajaba ditemtokake liya, pewarnaan bagean sing ngambang bebas ditindakake kaya sing diterangake ing ndhuwur (13) ing suhu kamar lan diaduk. Cekakipun, pisanan, irisan sing dipikolehi dipermeabilisasi nganggo 0,5% Triton X-100/PBS sajrone 15 menit ing suhu kamar; kanggo sawetara epitop (Pcx lan Shmt2), kanthi nggunakake buffer tris-EDTA ing suhu 80°C (PH 9) panasake irisan sajrone 25 menit tinimbang langkah iki. Sabanjure, bagean-bagean kasebut diinkubasi karo antibodi primer (waca Tabel S1) ing buffer pamblokiran (3% BSA/PBS) ing suhu 4°C sewengi karo diaduk. Dina candhake, bagean-bagean kasebut dikumbah nganggo buffer pamblokiran lan diinkubasi karo antibodi sekunder konjugasi fluorofor sing cocog sajrone 2 jam ing suhu kamar; pungkasane, bagean-bagean kasebut dikumbah kanthi tliti ing PBS, diwarnai nganggo DAPI, banjur difiksasi nganggo AquaPolymount ing slide mikroskop.
Mikroskop confocal pemindaian laser (TCS SP8-X utawa TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) sing dilengkapi laser cahya putih lan laser ultraviolet dioda 405 digunakake kanggo nggambarake sampel kasebut. Kanthi ngrangsang fluorofor lan ngumpulake sinyal nganggo Hybrid Detector (HyDs), piranti lunak LAS-X digunakake kanggo ngumpulake gambar sing ditumpuk sing cocog karo sampling Nyquist ing mode sekuensial: kanggo panel non-kuantitatif, sinyal kasebut dinamis banget (contone, ing sel somatik lan dendrit) mtYFP) Gunakake HyD kanggo ndeteksi jumlah PN ing mode BrightR). Gating saka 0,3 nganti 6 ns ditrapake kanggo nyuda latar mburi.
Pencitraan wektu nyata saka sel sing wis diurutake. Sawise diurutake ing medium Neurobasal-A sing ngemot suplemen B27 1% lan GlutaMax 0,5 mM, sel langsung diubengi ing slide kaca sing dilapisi poli-l-lisin (μ-Slide8 Well, Ibidi, nomer katalog 80826), banjur dijaga ing suhu 37°C lan 5% CO2 sajrone 1 jam supaya sel-sel kasebut mapan. Pencitraan wektu nyata ditindakake ing mikroskop confocal pemindaian laser Leica SP8 sing dilengkapi laser putih, HyD, lensa objektif lenga 63×[1,4 aperture numerik (NA)] lan tahap pemanasan.
Tikus kasebut cepet dibius nganggo karbon dioksida lan dipenggal sirahe, otak cepet dicopot saka tengkorak, lan dipotong dadi potongan sagital kandel 200μm (kanggo eksperimen pelabelan 13C) utawa kandel 275μm (kanggo rong eksperimen foton) sing diisi bahan-bahan ing ngisor iki. Es krim (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) diisi karo zat-zat ing ngisor iki: 125 mM cairan serebrospinal buatan (ACSF) Ca2 + es sing adhem, jenuh karbon (95% O2 lan 5% CO2) rendah Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosa, 0,5 mM CaCl2 lan 3,5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 nganti 330 mmol). Pindahna irisan otak sing dipikolehi menyang ruang pra-inkubasi sing ngemot Ca2 + ACSF sing luwih dhuwur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 lan 2,0 mM MgCl2) Sedheng) pH 7,4 lan 310 nganti 320 mmol).
Sajrone proses pencitraan, irisan-irisan kasebut dipindhah menyang ruang pencitraan khusus, lan eksperimen kasebut ditindakake kanthi perfusi ACSF terus-terusan ing suhu konstan 32° nganti 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) sing dilengkapi lensa objektif Leica 25x (NA 0.95, banyu), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) digunakake kanggo pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM saka Grx1-roGFP2. Owah-owahan ing kahanan redoks sitoplasmik PN diukur nganggo FLIM rong foton ing irisan otak sagital, ing ngendi biosensor Grx1-roGFP2 nargetake PN. Ing lapisan PN, lapangan akuisisi dipilih udakara 50 nganti 80 μm ing ngisor permukaan irisan kanggo mesthekake yen ana PN sing layak (yaiku, ora ana struktur manik-manik utawa owah-owahan morfologis neuronal ing sadawane dendrit) lan sensor roGFP2 positif ganda lan AAV sing ngode shRNA PCx utawa urutan kontrole (saben mCherry sing ngekspresikake). Kumpulake gambar tumpukan tunggal kanthi zoom digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: grup filter HyD internal, fluorescein isothiocyanate (FITC)] lan rata-rata gambar sajrone 2 nganti 3 menit digunakake kanggo mesthekake yen cukup foton sing dikumpulake (total 1000 foton) kanggo pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 lan verifikasi kondisi FLIM ditindakake kanthi ngawasi nilai umur roGFP2 nalika nambahake 10 mM H2O2 eksogen menyang perfusi ACSF (kanggo ngoptimalake oksidasi, sing nyebabake umur tambah), banjur nambahake 2 mM dithiothreitol (nyilikake derajat reduksi, sing nyebabake umur mudhun) (Gambar S8, D nganti G). Gunakake piranti lunak FLIMfit 5.1.1 kanggo nganalisis asil sing dipikolehi, pasake kurva peluruhan eksponensial tunggal saka kabeh gambar menyang IRF sing diukur (fungsi respon instrumen), lan χ2 kira-kira 1. Kanggo ngetung umur PN tunggal, topeng ing sekitar awak saraf digambar kanthi manual, lan umur rata-rata ing saben topeng digunakake kanggo kuantifikasi.
Analisis potensial mitokondria. Sawise potongan akut diinkubasi karo 100 nM TMRM sing langsung ditambahake menyang ACSF sing diperfusi sajrone 30 menit, owah-owahan potensial mitokondria PN diukur nganggo mikroskop rong foton. Pencitraan TMRM ditindakake kanthi ngrangsang probe ing 920 nm lan nggunakake HyD internal (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) kanggo ngumpulake sinyal; kanthi nggunakake dawa gelombang eksitasi sing padha nanging nggunakake HyD internal sing beda (FITC: 525/50) kanggo gambar mtYFP. Gunakake plug-in Kalkulator Gambar ImageJ kanggo ngevaluasi potensial mitokondria ing tingkat sel tunggal. Cekakipun, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) digunakake kanggo ngenali wilayah mitokondria sing nuduhake sinyal TMRM ing Purkinje Somali ing gambar confocal tumpukan tunggal saka saluran sing cocog. Banjur area piksel ing topeng sing diasilake diukur, banjur dinormalisasi ing gambar tumpukan tunggal ambang sing cocog saka saluran mtYFP kanggo entuk fraksi mitokondria sing nuduhake potensial mitokondria.
Gambar kasebut didekonvolusi nganggo piranti lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Kanggo gambar kothak sing wis dipindai, montase kothak siji digawe nggunakake algoritma jahitan otomatis sing diwenehake dening piranti lunak LAS-X. Sawise kalibrasi gambar, gunakake ImageJ lan Adobe Photoshop kanggo ngolah gambar luwih lanjut lan nyetel padhange lan kontras kanthi seragam. Gunakake Adobe Illustrator kanggo persiapan grafis.
Analisis fokus mtDNA. Cacahing lesi mtDNA diukur ing bagean serebelum sing diwenehi label antibodi nglawan DNA nganggo mikroskop confocal. Saben area target digawe kanggo awak sel lan inti saben sel, lan area kasebut diitung nggunakake plug-in Multi Measure (piranti lunak ImageJ). Kurangi area nuklir saka area awak sel kanggo entuk area sitoplasma. Pungkasan, plug-in Analyze Particles (piranti lunak ImageJ) digunakake kanggo kanthi otomatis ngukur titik DNA sitoplasma sing nuduhake mtDNA ing gambar ambang, lan asil sing dipikolehi dinormalisasi menyang rata-rata PN tikus CTRL. Asil kasebut dinyatakake minangka jumlah rata-rata nukleosida saben sel.
Analisis ekspresi protein. Gunakake plug-in Kalkulator Gambar ImageJ kanggo ngevaluasi ekspresi protein ing PN ing tingkat sel tunggal. Cekakipun, ing gambar confocal lapisan tunggal saka saluran sing cocog, liwat persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), wilayah mitokondria sing nuduhake imunoreaktivitas marang antibodi tartamtu ing Purkina diidentifikasi. Banjur area piksel ing topeng sing diasilake diukur, banjur dinormalisasi ing gambar tumpukan tunggal ambang sing cocog saka saluran mtYFP kanggo entuk fraksi mitokondria saka protein sing ditampilake.
Analisis kapadhetan sèl Purkinje. Plugin Cell Counter saka ImageJ digunakaké kanggo ngevaluasi kapadhetan Purkinje kanthi mbagi cacah sèl Purkinje sing diitung karo dawané cincin serebelum sing dikuwasani déning sèl sing diitung.
Persiapan lan pangumpulan sampel. Otak saka klompok kontrol lan tikus Mfn2cKO difiksasi ing 2% PFA/2,5% glutaraldehida ing 0,1 M buffer fosfat (PB), banjur potongan koronal disiapake nggunakake ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Kekandelan 50 nganti 60 μm) Banjur difiksasi ing buffer PB ing 1% os tetraoksida lan 1,5% kalium ferosianida ing suhu kamar suwene 1 jam. Potongan kasebut dicuci kaping telu nganggo banyu suling, banjur diwernani nganggo 70% etanol sing ngemot 1% uranil asetat suwene 20 menit. Potongan kasebut banjur didehidrasi ing alkohol bertingkat lan dilebokake ing resin epoksi Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, nomer katalog 14040) ing antarane slide kaca sing dilapisi silikon, lan pungkasane ing suhu 60°C dipolimerisasi ing oven suwene 48 jam. Area korteks serebelum dipilih lan bagean ultra tipis 50 nm dipotong ing Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) lan dipilih ing kisi celah tembaga 2 × 1 mm sing dilapisi film polistirena. Bagean kasebut diwernani nganggo larutan uranil asetat 4% ing H2O sajrone 10 menit, dicuci nganggo H2O kaping pirang-pirang, banjur nganggo sitrat timbal Reynolds ing H2O sajrone 10 menit, banjur dicuci nganggo H2O kaping pirang-pirang. Mikrograf dijupuk nganggo mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) nggunakake kamera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jerman).
Kanggo tikus sing kena infeksi AAV, otak dipisahake lan diiris dadi bagean sagital kandel 1 mm, lan serebelum ditliti nggunakake mikroskop fluoresensi kanggo ngenali cincin sing kena infeksi AAV (yaiku, ekspresi mCherry). Mung eksperimen ing ngendi injeksi AAV nyebabake efisiensi transduksi sing dhuwur banget saka lapisan sel Purkinje (yaiku meh kabeh lapisan) ing paling ora rong cincin serebelum berturut-turut sing digunakake. Loop transduksi AAV dibedah mikro kanggo fiksasi sewengi (4% PFA lan 2,5% glutaraldehida ing buffer kakaoat 0,1 M) lan diproses luwih lanjut. Kanggo penyisipan EPON, jaringan sing wis difiksasi dicuci nganggo buffer natrium kakaoat 0,1 M (Applichem), lan diinkubasi nganggo 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ing buffer natrium kakaoat 0,1 M (Applichem) sajrone 4 jam, banjur dicuci sajrone 2 jam. Baleni kaping 3 nganggo buffer kokamida 0,1 M. Sabanjure, seri etanol sing munggah digunakake kanggo nginkubasi saben larutan etanol ing suhu 4°C suwene 15 menit kanggo nggaringake jaringan. Jaringan kasebut dipindhah menyang propilen oksida lan diinkubasi sewengi ing EPON (Sigma-Aldrich) ing suhu 4°C. Selehake jaringan ing EPON seger ing suhu kamar suwene 2 jam, banjur lebokake ing suhu 62°C suwene 72 jam. Gunakake ultramikrotome (Leica Microsystems, UC6) lan piso berlian (Diatome, Biel, Swiss) kanggo ngethok bagean ultra tipis 70 nm, lan diwernani nganggo uranil asetat 1,5% suwene 15 menit ing suhu 37°C, lan diwernani nganggo larutan timbal sitrat suwene 4 menit. Mikrograf elektron dijupuk nggunakake mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) sing dilengkapi Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) lan piranti lunak DigitalMicrograph (Gatan). Kanggo analisis, mikrograf elektron dijupuk nganggo zoom digital 5000× utawa 10.000×.
Analisis morfologis mitokondria. Kanggo kabeh analisis, kontur mitokondria individu digarisake kanthi manual ing gambar digital nggunakake piranti lunak ImageJ. Parameter morfologis sing beda-beda dianalisis. Kapadhetan mitokondria dinyatakake minangka persentase sing dipikolehi kanthi mbagi total area mitokondria saben sel karo area sitoplasma (area sitoplasma = area sel-area inti sel) × 100. Kebulat mitokondria diitung nganggo rumus [4π∙(area/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria dianalisis lan dipérang dadi rong kategori (“tubular” lan “blister”) miturut bentuk utama.
Analisis jumlah lan kapadhetan autofagosom/lisosom. Gunakake piranti lunak ImageJ kanggo nggambarake kontur saben autofagosom/lisosom kanthi manual ing gambar digital. Area autofagosom/lisosom dinyatakake minangka persentase sing diitung kanthi mbagi total area struktur autofagosom/lisosom saben sel karo area sitoplasma (area sitoplasma=area sel-area inti) × 100. Kapadhetan autofagosom/lisosom diitung kanthi mbagi total jumlah karo jumlah struktur autofagosom/lisosom saben sel (miturut area sitoplasma) (area sitoplasma = area sel-area inti).
Pelabelan kanggo pemotongan akut lan persiapan sampel. Kanggo eksperimen sing mbutuhake pelabelan glukosa, pindhah irisan otak akut menyang ruang pra-inkubasi, sing ngemot karbon jenuh (95% O2 lan 5% CO2), Ca2 + ACSF sing dhuwur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 lan 2,0 mM MgCl2, sing diatur dadi pH 7,4 lan 310 nganti 320 mOsm), ing ngendi glukosa yaiku 13C6- Substitusi glukosa (Eurisotop, nomer katalog CLM-1396). Kanggo eksperimen sing mbutuhake label piruvat, pindhah irisan otak akut menyang Ca2 + ACSF sing luwih dhuwur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 lan Tambah 2,0 mM MgCl2, atur nganti pH 7,4 lan 310 nganti 320 mOsm), lan tambahake 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomer katalog CLM-1082). Inkubasi potongan kasebut sajrone 90 menit ing suhu 37°C. Ing pungkasan eksperimen, potongan kasebut cepet dikumbah nganggo larutan banyu (pH 7,4) sing ngemot 75 mM amonium karbonat, banjur dihomogenisasi ing 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: banyu. Sawisé potongan-potongan kasebut diinkubasi ing es sajrone 30 menit, sampel kasebut disentrifugasi ing 21.000 g sajrone 10 menit ing suhu 4°C, lan supernatan sing bening dikeringake ing konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit garing sing diasilake disimpen ing suhu -80°C nganti dianalisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa saka 13 asam amino berlabel C. Kanggo analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit disuspensi maneh ing 75μl banyu kelas LC-MS (Honeywell). Sawise sentrifugasi ing 21.000 g sajrone 5 menit ing suhu 4°C, 20 μl supernatan sing wis diklarifikasi digunakake kanggo analisis fluks asam amino, dene ekstrak liyane langsung digunakake kanggo analisis anion (deleng ing ngisor iki). Analisis asam amino ditindakake nggunakake protokol derivatisasi benzoil klorida sing wis diterangake sadurunge (55, 56). Ing langkah pertama, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) ditambahake menyang 20μl ekstrak metabolit, banjur 10μl 2% benzoil klorida (Sigma-Aldrich) ditambahake menyang ACN kelas LC. Sampel kasebut divorteks sedhela banjur disentrifugasi ing 21.000 g sajrone 5 menit ing suhu 20°C. Pindahake supernatan sing wis diresiki menyang botol autosampler 2 ml nganggo sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisis nggunakake sistem LC kinerja ultra-tinggi Acquity iClass (Waters) sing disambungake menyang spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Kanggo analisis, 2μl sampel sing diderivatisasi diinjeksi menyang kolom silika T3 kekuatan tinggi 100 × 1,0 mm (Waters) sing ngemot partikel 1,8μm. Laju aliran yaiku 100μl/menit, lan sistem buffer kasusun saka buffer A (10 mM amonium format lan 0,15% asam format ing banyu) lan buffer B (ACN). Gradien kasebut kaya ing ngisor iki: 0%B ing 0 menit; 0%B. 0 nganti 15% B ing 0 nganti 0,1 menit; 15 nganti 17% B ing 0,1 nganti 0,5 menit; B ing 17 nganti 55% ing 0,5 nganti 14 menit; B ing 55 nganti 70% ing 14 nganti 14,5 menit; ing 14,5 nganti 70 nganti 100% B ing 18 menit; 100% B ing 18 nganti 19 menit; 100 nganti 0% B ing 19 nganti 19,1 menit; 0% B ing 19,1 nganti 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi ing mode ionisasi positif kanthi rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 nganti 750. Resolusi sing ditrapake yaiku 60.000, lan target ion kontrol gain (AGC) sing dipikolehi yaiku 3 × 106, lan wektu ion maksimum yaiku 100 milidetik. Sumber ionisasi elektrospray (ESI) sing dipanasake beroperasi ing voltase semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250 °C, aliran udara selubung 60 AU (unit sewenang-wenang), lan aliran udara tambahan 20 AU. 250 °C. Lensa S disetel menyang 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS saka asam organik berlabel 13C. Endapan metabolit sing isih ana (55μl) dianalisis nggunakake sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) sing disambungake menyang spektrometer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Cekakipun, 5μl ekstrak metabolit diinjeksi menyang kolom Dionex IonPac AS11-HC sing dilengkapi HPLC (2 mm × 250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) ing mode puteran parsial push-in kanthi rasio pengisian 1. ) Kolom penjaga Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu kolom dijaga ing 30°C, lan autosampler disetel menyang 6°C. Gunakake kartrid kalium hidroksida sing diwenehake banyu deionisasi kanggo ngasilake gradien kalium hidroksida liwat generator eluen. Pamisahan metabolit kanthi laju aliran 380μl/menit, kanthi ngetrapake gradien ing ngisor iki: 0 nganti 3 menit, 10 mM KOH; 3 nganti 12 menit, 10 nganti 50 mM KOH; 12 nganti 19 menit, 50 nganti 100 mM KOH; 19 nganti 21 menit, 100 mM KOH; 21 nganti 21,5 menit, 100 nganti 10 mM KOH. Kolom kasebut diseimbangake maneh ing 10 mM KOH sajrone 8,5 menit.
Metabolit sing wis dielusi digabungake karo aliran suplemen isopropanol 150μl/menit sawise kolom lan banjur diarahake menyang spektrometer massa resolusi dhuwur sing beroperasi ing mode ionisasi negatif. MS ngawasi kisaran massa saka m/z 50 nganti 750 kanthi resolusi 60.000. AGC disetel dadi 1 × 106, lan wektu ion maksimum dijaga ing 100 ms. Sumber ESI sing dipanasake dioperasikake ing voltase semprotan 3,5 kV. Setelan liyane saka sumber ion yaiku kaya ing ngisor iki: suhu kapiler 275 °C; aliran gas selubung, 60 AU; aliran gas tambahan, 20 AU ing 300 °C, lan setelan lensa S dadi 60 AU.
Analisis data metabolit sing diwenehi label 13C. Gunakake piranti lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) kanggo analisis data rasio isotop. Identitas saben senyawa diverifikasi dening senyawa referensi sing bisa dipercaya lan dianalisis kanthi mandiri. Kanggo nindakake analisis pengayaan isotop, area kromatogram ion sing diekstrak (XIC) saka saben isotop 13C (Mn) diekstrak saka [M + H] +, ing ngendi n minangka nomer karbon saka senyawa target, sing digunakake kanggo nganalisis asam amino utawa [MH] + digunakake kanggo nganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang saka limang bagean per yuta, lan akurasi RT yaiku 0,05 menit. Analisis pengayaan ditindakake kanthi ngetung rasio saben isotop sing dideteksi karo jumlah kabeh isotop saka senyawa sing cocog. Rasio kasebut diwenehake minangka nilai persentase kanggo saben isotop, lan asil kasebut dinyatakake minangka pengayaan persen molar (MPE), kaya sing diterangake sadurunge (42).
Pelet neuron sing beku dihomogenisasi ing metanol 80% sing adhem (v/v), divorteks, lan diinkubasi ing suhu -20°C suwene 30 menit. Vorteks sampel maneh lan aduk ing suhu +4°C suwene 30 menit. Sampel disentrifugasi ing 21.000 g suwene 5 menit ing suhu 4°C, banjur supernatan sing diasilake dikumpulake lan dikeringake nggunakake konsentrator SpeedVac ing suhu 25°C kanggo analisis sabanjure. Kaya sing diterangake ing ndhuwur, analisis LC-MS ditindakake ing asam amino saka sel sing wis diurutake. Nggunakake TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data ditindakake nggunakake massa monoisotop saben senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit ditindakake nggunakake paket piranti lunak preprocessCore (57).
Persiapan irisan. Tikus cepet dibius nganggo karbon dioksida lan dipenggal sirahe, otak cepet dicopot saka tengkorak, lan piso geter sing diisi es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) digunakake kanggo ngethok dadi potongan sagital 300 nganti 375 μm. Gasifikasi karbon adhem (95% O2 lan 5% CO2) Ca2 + ACSF rendah (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 lan 6,0 mM MgCl2. Atur dadi pH 7,4 lan 310 nganti 330 mOsm). Pindahna irisan otak sing dipikolehi menyang kamar sing ngemot Ca2 + ACSF sing luwih dhuwur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 mM CaCl2 lan mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 lan 310 nganti 320 mOsm). Simpen irisan kasebut sajrone 20 nganti 30 menit supaya bisa dipulihake sadurunge direkam.
rekaman. Panggung mikroskop sing dilengkapi ruang rekaman tetep lan lensa objektif rendaman banyu 20x (Scientifica) digunakake kanggo kabeh rekaman. Sel Purkinje sing diduga diidentifikasi kanthi (i) ukuran awak, (ii) lokasi anatomi serebelum, lan (iii) ekspresi gen reporter mtYFP fluoresen. Pipet tempel kanthi resistensi ujung 5 nganti 11 megohm ditarik metu dening kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) lan pipet horisontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Kabeh rekaman ditindakake dening penguat penjepit tempel npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), sing dikontrol dening piranti lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Inggris). Eksperimen kasebut direkam kanthi kecepatan sampling 12,5 kHz. Sinyal kasebut disaring nganggo rong filter Bessel short-pass kanthi frekuensi cutoff 1,3 lan 10 kHz. Kapasitansi membran lan pipet dikompensasi dening sirkuit kompensasi nggunakake amplifier. Kabeh eksperimen ditindakake ing sangisore kontrol kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), sing dikontrol dening piranti lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi lan analisis sel utuh rutin. Sadurunge direkam, isi pipet nganggo larutan internal sing ngemot zat-zat ing ngisor iki: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosin trifosfat (GTP) (Na) lan 10,0 mM kreatinin fosfat diatur dadi pH 7,25, lan tekanan osmotik yaiku 290 mOsm (sukrosa). Sanalika sawise ngetrapake gaya 0 pA kanggo mecah membran, potensial membran istirahat diukur. Resistensi input diukur kanthi ngetrapake arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, lan -10 pA. Ukur gedhene respon voltase lan gunakake hukum Ohm kanggo ngetung resistensi input. Aktivitas spontan direkam ing klem voltase sajrone 5 menit, lan sPSC diidentifikasi lan diukur ing Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) nggunakake skrip pangenalan semi-otomatis. Kurva IV lan arus steady-state diukur kanthi ngjepit baterei ing potensial sing beda-beda (diwiwiti saka -110 mV) lan nambah voltase ing langkah 5 mV. Produksi AP diuji kanthi ngetrapake arus depolarisasi. Jepit sel ing -70 mV nalika ngetrapake pulsa arus depolarisasi. Atur ukuran langkah saben unit rekaman kanthi kapisah (10 nganti 60 pA). Hitung frekuensi AP maksimum kanthi ngetung lonjakan pulsa kanthi manual sing nyebabake frekuensi AP paling dhuwur. Ambang AP dianalisis kanthi nggunakake turunan kapindho saka pulsa depolarisasi sing pisanan micu siji utawa luwih AP.
Konfigurasi lan analisis patch sing dilubangi. Lakoni rekaman patch sing dilubangi nggunakake protokol standar. Gunakake pipet bebas ATP lan GTP sing ora ngemot bahan-bahan ing ngisor iki: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA lan 2 mM MgCl2, lan atur nganti pH 7,2 (nggunakake KOH). ATP lan GTP ora dilebokake ing larutan intraseluler kanggo nyegah permeabilitas membran sel sing ora terkendali. Pipet patch diisi larutan internal sing ngemot amfoterisin (kurang luwih 200 nganti 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) kanggo entuk rekaman patch sing dilubangi. Amfoterisin dilarutake ing dimetil sulfoksida (konsentrasi pungkasan: 0,1 nganti 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO sing digunakake ora duwe efek sing signifikan marang neuron sing ditliti. Sajrone proses punching, resistensi saluran (Ra) terus dipantau, lan eksperimen diwiwiti sawise amplitudo Ra lan AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan diukur ing klem voltase lan/utawa arus sajrone 2 nganti 5 menit. Analisis data ditindakake nggunakake Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) lan GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Kanggo ngenali AP spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro digunakake. Ngenali AP kanthi otomatis nggunakake ambang sing diwenehake, sing diatur kanthi individu kanggo saben rekaman. Nggunakake interval lonjakan, nemtokake frekuensi lonjakan kanthi frekuensi lonjakan sesaat maksimum lan frekuensi lonjakan rata-rata.
Isolasi PN. Kanthi adaptasi karo protokol sing diterbitake sadurunge, PN dimurnèkaké saka serebelum tikus ing tahap sing wis ditemtokake (58). Cekakipun, serebelum dibedah lan dicincang ing medium disosiasi sing adhem banget [tanpa HBSS Ca2+ lan Mg2+, ditambah karo glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) lan streptomisin (0,05 mg/ml)], banjur dicerna medium kasebut ing papain [HBSS, ditambah karo 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) lan deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Diobati sajrone 30 menit ing suhu 30°C. Kapisan, wisuh jaringan ing medium HBSS sing ngandhut lendir endhog (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) lan DNase (0,1 mg/ml) ing suhu ruangan kanggo nyegah pencernaan enzimatik, banjur ing medium HBSS sing ngandhut glukosa 20 mM. Giling alon-alon ing HBSS, penisilin (50 U/ml), streptomisin (0,05 mg/ml) lan DNase (0,1 mg/ml) ngeculake sel tunggal. Suspensi sel sing diasilake disaring liwat saringan sel 70μm, banjur sel-sel kasebut di-pellet kanthi sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) lan disuspensi maneh ing medium sortir [HBSS, ditambah karo glukosa 20 mM, 20% janin sapi) Serum, penisilin (50 U/ml) lan streptomisin (0,05 mg/ml)]; evaluasi kelangsungan urip sel nganggo propidium iodida lan atur kapadhetan sel dadi 1 × 106 nganti 2 × 106 sel/ml. Sadurunge flow cytometry, suspensi disaring nganggo saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran. Pemilahan sel ditindakake ing suhu 4°C nggunakake mesin FACSAria III (BD Biosciences) lan piranti lunak FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel diurut nggunakake nozzle 100 μm ing tekanan 20 psi kanthi kecepatan ~2800 kedadeyan/detik. Amarga kriteria gating tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, lan karakteristik hamburan) ora bisa njamin isolasi PN sing bener saka jinis sel liyane, strategi gating disetel adhedhasar perbandingan langsung intensitas YFP lan autofluoresensi ing mitoYFP+ ​​​​lan kontrol mitoYFP − Mice. YFP dieksitasi kanthi nyinari sampel nganggo garis laser 488 nm, lan sinyal kasebut dideteksi nggunakake filter band pass 530/30 nm. Ing tikus mitoYFP+ ​​​​, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP uga digunakake kanggo mbedakake fragmen awak neuronal lan akson. 7-AAD dieksitasi nganggo laser kuning 561 nm lan dideteksi nganggo filter bandpass 675/20 nm kanggo ngilangi sel mati. Kanggo misahake astrosit ing wektu sing padha, suspensi sel diwernani nganggo ACSA-2-APC, banjur sampel diiradiasi nganggo garis laser 640 nm, lan filter bandpass 660/20 nm digunakake kanggo ndeteksi sinyal kasebut.
Sel sing diklumpukake di-pellet nganggo sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) lan disimpen ing suhu -80°C nganti digunakake. Tikus Mfn2cKO lan anak-anake diklasifikasikake ing dina sing padha kanggo nyuda variabilitas prosedural. Presentasi lan analisis data FACS ditindakake nggunakake piranti lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Kaya sing wis kasebut ing ndhuwur (59), PCR wektu nyata digunakake kanggo ngisolasi DNA saka neuron sing wis diurutake kanggo kuantifikasi mtDNA sabanjure. Linearitas lan sensitivitas ambang batas wiwitane diuji kanthi mbukak qPCR ing macem-macem jumlah sel. Cekakipun, kumpulake 300 PN ing buffer lisis sing kasusun saka 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 lan proteinase K (200 ng/ml) lan inkubasi ing suhu 55°C sajrone 120 menit. Sel-sel kasebut banjur diinkubasi maneh ing suhu 95°C sajrone 10 menit kanggo mesthekake inaktivasi proteinase K kanthi lengkap. Nggunakake probe TaqMan (Thermo Fisher) khusus kanggo mt-Nd1, mtDNA diukur kanthi PCR semi-kuantitatif ing sistem PCR Wektu Nyata 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Gen-gen Sains, nomer katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog AIVI3E8) lan 18S (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog Hs99999901_s1).
Persiapan sampel proteom. Kanthi manasi larutan ing suhu 95°C sajrone 10 menit lan sonikasi, ing buffer lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida lan 100 mM pelet neuron beku tris-Lise ing HCl]. Ing Bioruptor (Diagenode) sajrone 10 menit (pulsa 30 detik / periode jeda 30 detik). Sampel diencerake 1:10 ing 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dicampur karo 300 ng tripsin emas (Promega), lan diinkubasi sewengi ing suhu 37°C kanggo entuk pencernaan sing lengkap. Ing dina kapindho, sampel disentrifugasi ing 20.000 g sajrone 20 menit. Supernatan diencerake karo asam format 0,1%, lan larutan kasebut didesaltisasi karo StageTips sing digawe dhewe. Sampel kasebut dikeringake ing instrumen SpeedVac (konsentrator Eppendorf ditambah 5305) ing suhu 45°C, banjur peptida kasebut disuspensi ing asam format 0,1%. Kabeh sampel disiapake bebarengan dening wong sing padha. Kanggo nganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida sing didesaltifikasi diwenehi label nganggo tag massa tandem (TMT10plex, nomer katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) kanthi rasio reagen peptida karo TMT 1:20. Kanggo menehi label TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensi maneh ing 70 μl ACN anhidrat, lan peptida sing wis garing dibentuk maneh dadi 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat), sing ditambahake 7 μl reagen TMT ing ACN. Konsentrasine yaiku 43,75%. Sawise 60 menit inkubasi, reaksi kasebut dipadamkan nganggo 2 μl 5% hidroksilamin. Peptida sing diwenehi label dikumpulake, dikeringake, disuspensi maneh ing 200μl asam format 0,1% (FA), dipérang dadi loro, banjur didegarasi nganggo StageTips gawean dhewe. Nggunakake kromatografi cair kinerja ultra tinggi UltiMate 3000 (kromatografi cair kinerja ultra tinggi UltiMate 3000), salah siji saka rong bagian difraksinasi ing kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm sing diisi partikel C18 130Å1,7μm (Waters, katalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Pisah peptida kanthi laju aliran 30μl/menit, pisah saka buffer B 1% nganti 50% sajrone 85 menit kanthi gradien langkah demi langkah 96 menit, saka buffer B 50% nganti 95% sajrone 3 menit, banjur 8 menit kanggo Buffer B 95%; Buffer A yaiku 5% ACN lan 10 mM amonium bikarbonat (ABC), lan buffer B yaiku 80% ACN lan 10 mM ABC. Kumpulake fraksi saben 3 menit lan gabungke dadi rong klompok (1 + 17, 2 + 18, lsp.) lan garingake ing centrifuge vakum.
Analisis LC-MS/MS. Kanggo spektrometri massa, peptida (nomer r119.aq) dipisahake ing kolom analitik PicoFrit diameter njero 25 cm, 75 μm (lensa objektif anyar, nomer bagean PF7508250) sing dilengkapi medium ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), Gunakake EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom kasebut dijaga ing suhu 50°C. Buffer A lan B yaiku 0,1% asam format ing banyu lan 0,1% asam format ing 80% ACN. Peptida dipisahake saka 6% nganti 31% buffer B sajrone 65 menit lan saka 31% nganti 50% buffer B sajrone 5 menit kanthi gradien 200 nl/menit. Peptida sing dielusi dianalisis ing spektrometer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pangukuran prekursor peptida m/z ditindakake kanthi resolusi 120.000 ing kisaran 350 nganti 1500 m/z. Nggunakake energi tabrakan normal 27%, prekursor paling kuat kanthi status muatan 2 nganti 6 dipilih kanggo pembelahan disosiasi jebakan C (HCD) energi dhuwur. Wektu siklus disetel dadi 1 detik. Nilai m/z saka fragmen peptida diukur ing jebakan ion nggunakake target AGC paling cilik yaiku 5 × 104 lan wektu injeksi maksimum 86 ms. Sawise fragmentasi, prekursor dilebokake ing dhaptar pengecualian dinamis sajrone 45 detik. Peptida sing diwenehi label TMT dipisahake ing kolom Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog 164942), lan spektrum migrasi dianalisis ing spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) sing dilengkapi peralatan ion gelombang asimetris medan tinggi (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) beroperasi ing rong voltase kompensasi −50 lan −70 V. MS3 sing dipilih adhedhasar prekursor sinkronisasi digunakake kanggo pangukuran sinyal ion laporan TMT. Pamisahan peptida ditindakake ing EASY-nLC 1200, nggunakake elusi gradien linier 90%, kanthi konsentrasi buffer 6% nganti 31%; buffer A yaiku 0,1% FA, lan buffer B yaiku 0,1% FA lan 80% ACN. Kolom analitis dioperasikake ing 50°C. Gunakake FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) kanggo misahake file asli miturut voltase kompensasi FAIMS.
Identifikasi lan kuantifikasi protein. Nggunakake mesin telusur Andromeda terintegrasi, data asli dianalisis nggunakake MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Saliyane urutan Cre recombinase lan YFP sing dipikolehi saka Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida digoleki kanggo urutan kanonik lan urutan isoform saka proteom referensi tikus (ID Proteome UP000000589, diunduh saka UniProt ing Mei 2017). Oksidasi metionin lan asetilasi N-terminal protein disetel minangka modifikasi variabel; metilasi sistein karbamoil disetel minangka modifikasi tetep. Parameter pencernaan disetel dadi "spesifisitas" lan "tripsin/P". Jumlah minimal peptida lan peptida cukur sing digunakake kanggo identifikasi protein yaiku 1; jumlah minimal peptida unik yaiku 0. Ing kahanan pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein yaiku 0,01. Opsi "Peptida Kapindho" diaktifake. Gunakake opsi "cocog antarane proses" kanggo nransfer identifikasi sing sukses antarane file asli sing beda. Gunakake jumlah rasio minimal LFQ 1 kanggo kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ disaring kanggo paling ora rong nilai sing valid ing paling ora siji klompok genotipe ing saben titik wektu, lan diekstrapolasi saka distribusi normal kanthi jembar .0.3 lan mudhun 1.8. Gunakake platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) lan R (https://r-project.org/) kanggo nganalisis asil LFQ. Uji t moderat rong arah saka paket piranti lunak limma digunakake kanggo analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksplorasi ditindakake nggunakake ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally lan pheatmap. Data proteomik berbasis TMT dianalisis nggunakake MaxQuant versi 1.6.10.43. Goleki data proteomik mentah saka basis data proteomik manungsa UniProt, sing diundhuh ing September 2018. Analisis kasebut kalebu faktor koreksi kemurnian isotop sing diwenehake dening pabrikan. Gunakake limma ing R kanggo analisis ekspresi diferensial. Data asli, asil panelusuran basis data, lan alur kerja lan asil analisis data kabeh disimpen ing aliansi ProteomeXchange liwat repositori mitra PRIDE kanthi pengenal set data PXD019690.
Anotasi fungsional nambahi analisis. Piranti Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) digunakake kanggo nemtokake kasugihan istilah anotasi fungsional saka set data ing 8 minggu (Gambar 1). Cekakipun, dhaptar protein kuantitatif sing dipikolehi saka analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) digunakake kanthi kriteria filter ing ngisor iki: Mus musculus dipilih minangka spesies lan latar mburi, lan kategori kasebut nuduhake nilai P sing diatur dening Benjamini kanggo pengayaan 0,05 utawa luwih murah dianggep signifikan. Kanggo grafik iki, limang kategori kelebihan paling dhuwur ing saben kluster adhedhasar nilai P sing diatur ditampilake. Nggunakake uji-t ganda, nggunakake program dorongan linier rong tahap saka Benjamini, Krieger, lan Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein wektu-kursus ditindakake ing calon penting sing diidentifikasi ing saben kategori, lan saben baris dianalisis kanthi kapisah. Ora perlu nggunakake SD sing konsisten.
Kanggo mbandhingake asil panliten iki karo basis data sing wis diterbitake lan ngasilake diagram Venn ing Gambar 1, kita nggabungake dhaptar protein kuantitatif karo anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunakake alat online Gambar Diagram Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) kanggo ngasilake diagram.
Kanggo informasi rinci babagan prosedur statistik sing digunakake kanggo analisis proteomik, delengen bagean sing cocog ing Bahan lan Metode. Kanggo kabeh eksperimen liyane, informasi rinci bisa ditemokake ing legenda sing cocog. Kajaba ditemtokake liya, kabeh data ditulis minangka rata-rata ± SEM, lan kabeh analisis statistik ditindakake nggunakake piranti lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Kanggo materi tambahan kanggo artikel iki, mangga deleng http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Iki minangka artikel akses terbuka sing disebarake miturut syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sing ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi ing media apa wae, anggere panggunaan pungkasan ora kanggo keuntungan komersial lan premise yaiku karya asline bener. Referensi.
Cathetan: Kita mung njaluk sampeyan menehi alamat email supaya wong sing sampeyan rekomendasikake menyang kaca kasebut ngerti yen sampeyan pengin dheweke ndeleng email kasebut lan dudu spam. Kita ora bakal nangkep alamat email apa wae.
Pitakonan iki digunakake kanggo nguji apa sampeyan pengunjung lan nyegah kiriman spam otomatis.
Miturut E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional nuduhake yen program metabolisme diaktifake kanggo nglawan neurodegenerasi.
Miturut E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron disfungsional nuduhake yen program metabolisme diaktifake kanggo nglawan neurodegenerasi.
© 2020 American Association for the Advancement of Science. kabeh hak dilindhungi undhang-undhang. AAAS minangka mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef lan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.