Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo asil sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake versi browser sing luwih anyar (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita nampilake situs tanpa gaya utawa JavaScript.
Asam propionat (PPA) digunakake kanggo nyinaoni peran disfungsi mitokondria ing kelainan neurodevelopmental kayata kelainan spektrum autisme. PPA dikenal bisa ngganggu biogenesis, metabolisme, lan turnover mitokondria. Nanging, efek PPA ing dinamika mitokondria, fisi lan fusi tetep dadi masalah amarga sifat temporal sing kompleks saka mekanisme kasebut. Ing kene, kita nggunakake teknik pencitraan kuantitatif komplementer kanggo nyelidiki kepiye PPA mengaruhi ultrastruktur, morfologi, lan dinamika mitokondria ing sel SH-SY5Y kaya neuron. PPA (5 mM) nyebabake penurunan sing signifikan ing area mitokondria (p < 0,01), diameter lan keliling Feret (p < 0,05), lan area 2 (p < 0,01). Analisis locator acara mitokondria nuduhake peningkatan sing signifikan (p < 0,05) ing acara fisi lan fusi, saengga njaga integritas jaringan mitokondria ing kahanan stres. Kajaba iku, ekspresi mRNA saka cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) lan OPA1 (p < 0,05) mudhun sacara signifikan. 01). Iki nggambarake remodeling morfologi mitokondria, biogenesis lan dinamika kanggo njaga fungsi ing kahanan stres. Data kita menehi wawasan anyar babagan efek PPA ing dinamika mitokondria lan nyoroti kegunaan teknik pencitraan kanggo nyinaoni mekanisme pengaturan kompleks sing ana gandhengane karo respon stres mitokondria.
Mitokondria minangka peserta integral ing macem-macem fungsi seluler ngluwihi peran khas ing produksi energi lan biosintesis. Metabolisme mitokondria minangka regulator utama sinyal kalsium, homeostasis metabolisme lan redoks, sinyal inflamasi, modifikasi epigenetik, proliferasi sel, diferensiasi lan pati sel terprogram1. Utamane, metabolisme mitokondria penting banget kanggo perkembangan neuronal, kaslametan lan fungsi lan akeh terlibat ing macem-macem manifestasi neuropatologi2,3,4.
Sajrone dasawarsa kepungkur, status metabolisme wis muncul minangka regulator pusat neurogenesis, diferensiasi, pematangan lan plastisitas5,6. Bubar, morfologi lan dinamika mitokondria wis dadi komponen mitosis sing penting banget, proses dinamis sing njaga kolam mitokondria sing sehat ing njero sel. Dinamika mitokondria diatur dening jalur sing saling gumantung sing kompleks wiwit saka biogenesis mitokondria lan bioenergetika nganti fisi mitokondria, fusi, transportasi lan pembersihan7,8. Gangguan saka salah sawijining mekanisme integratif iki ngganggu pangopènan jaringan mitokondria sing sehat lan nduweni akibat fungsional sing jero kanggo perkembangan saraf9,10. Pancen, disregulasi dinamika mitokondria diamati ing akeh kelainan psikiatri, neurodegeneratif lan perkembangan saraf, kalebu kelainan spektrum autisme (ASD)11,12.
ASD minangka kelainan neurodevelopmental heterogen kanthi arsitektur genetik lan epigenetik sing kompleks. Pewarisan ASD ora bisa dibantah, nanging etiologi molekuler sing ndasari isih kurang dingerteni. Ngumpulake data saka model praklinis, studi klinis, lan set data molekuler multi-omics nyedhiyakake bukti disfungsi mitokondria sing saya tambah ing ASD13,14. Sadurunge kita nindakake skrining metilasi DNA genom ing kohort pasien ASD lan ngidentifikasi gen sing dimetilasi kanthi beda sing dikelompokake ing sadawane jalur metabolisme mitokondria15. Sabanjure kita nglaporake metilasi diferensial saka regulator pusat biogenesis lan dinamika mitokondria, sing ana gandhengane karo tambah akeh jumlah salinan mtDNA lan profil metabolisme urin sing diganti ing ASD16. Data kita nyedhiyakake bukti sing saya tambah yen dinamika mitokondria lan homeostasis nduweni peran penting ing patofisiologi ASD. Mulane, ningkatake pangerten mekanistik babagan hubungan antarane dinamika, morfologi, lan fungsi mitokondria minangka tujuan utama riset sing terus-terusan babagan penyakit neurologis sing ditondoi dening disfungsi mitokondria sekunder.
Teknik molekuler asring digunakake kanggo nyinaoni peran gen tartamtu ing respon stres mitokondria. Nanging, pendekatan iki bisa uga diwatesi dening sifat multifaset lan temporal saka mekanisme kontrol mitosis. Kajaba iku, ekspresi diferensial gen mitokondria minangka indikator ora langsung saka owah-owahan fungsional, utamane amarga mung sawetara gen sing biasane dianalisis. Mulane, metode sing luwih langsung kanggo nyinaoni fungsi mitokondria lan bioenergetika wis diusulake17. Morfologi mitokondria raket banget karo dinamika mitokondria. Wangun, konektivitas, lan struktur mitokondria penting banget kanggo produksi energi lan kaslametan mitokondria lan sel5,18. Kajaba iku, macem-macem komponen mitosis fokus ing owah-owahan ing morfologi mitokondria, sing bisa dadi titik pungkasan sing migunani kanggo disfungsi mitokondria lan nyedhiyakake basis kanggo studi mekanistik sabanjure.
Morfologi mitokondria bisa diamati langsung nggunakake mikroskop elektron transmisi (TEM), sing ngidini panliten rinci babagan ultrastruktur seluler. TEM langsung nggambarake morfologi, bentuk, lan struktur krista mitokondria ing resolusi mitokondria individu, tinimbang mung gumantung ing transkripsi gen, ekspresi protein, utawa parameter fungsional mitokondria ing populasi sel17,19,20. Kajaba iku, TEM nggampangake panliten interaksi antarane mitokondria lan organel liyane, kayata retikulum endoplasma lan autofagosom, sing nduweni peran penting ing fungsi mitokondria lan homeostasis21,22. Mangkono, iki ndadekake TEM minangka titik awal sing apik kanggo nyinaoni disfungsi mitokondria sadurunge fokus ing jalur utawa gen tartamtu. Amarga fungsi mitokondria saya relevan karo neuropatologi, ana kebutuhan sing jelas kanggo bisa nyinaoni morfologi lan dinamika mitokondria kanthi langsung lan kuantitatif ing model neuronal in vitro.
Ing artikel iki, kita nliti dinamika mitokondria ing model neuronal disfungsi mitokondria ing gangguan spektrum autisme. Sadurunge, kita nglaporake metilasi diferensial propionil-CoA karboksilase beta (PCCB) ing ASD15, subunit enzim propionil-CoA karboksilase mitokondria PCC. Disregulasi PCC dikenal nyebabake akumulasi beracun turunan propionil, kalebu asam propionat (PPA)23,24,25. PPA wis dituduhake ngganggu metabolisme neuronal lan ngowahi prilaku in vivo lan minangka model kewan sing wis ditetepake kanggo nyinaoni mekanisme neurodevelopmental sing melu ASD26,27,28. Kajaba iku, PPA wis dilaporake ngganggu potensial membran mitokondria, biogenesis lan respirasi in vitro lan wis digunakake sacara wiyar kanggo model disfungsi mitokondria ing neuron29,30. Nanging, dampak disfungsi mitokondria sing diinduksi PPA ing morfologi lan dinamika mitokondria isih kurang dingerteni.
Panliten iki nggunakake teknik pencitraan komplementer kanggo ngukur efek PPA ing morfologi, dinamika, lan fungsi mitokondria ing sel SH-SY5Y. Kapisan, kita ngembangake metode TEM kanggo nggambarake owah-owahan ing morfologi lan ultrastruktur mitokondria17,31,32. Amarga sifat dinamis mitokondria33, kita uga nggunakake analisis lokalisasi acara mitokondria (MEL) kanggo ngukur owah-owahan ing keseimbangan antarane kedadeyan fisi lan fusi, jumlah lan volume mitokondria ing stres PPA. Pungkasan, kita mriksa apa morfologi lan dinamika mitokondria ana gandhengane karo owah-owahan ing ekspresi gen sing melu biogenesis, fisi, lan fusi. Dijupuk bebarengan, data kita nggambarake tantangan kanggo njlentrehake kerumitan mekanisme sing ngatur dinamika mitokondria. Kita nyoroti kegunaan TEM ing sinau morfologi mitokondria minangka titik pungkasan mitosis konvergen sing bisa diukur ing sel SH-SY5Y. Kajaba iku, kita nyoroti manawa data TEM nyedhiyakake informasi paling sugih nalika digabungake karo teknik pencitraan sing uga nangkep kedadeyan dinamis minangka respon kanggo stres metabolik. Karakterisasi luwih lanjut babagan mekanisme pengaturan molekuler sing ndhukung mitosis sel neuronal bisa menehi wawasan penting babagan komponen mitokondria sistem saraf lan penyakit neurodegeneratif.
Kanggo ngindhuksi stres mitokondria, sel SH-SY5Y diobati nganggo PPA nggunakake 3 mM lan 5 mM natrium propionat (NaP). Sadurunge TEM, sampel dipreparasi sampel kriogenik nggunakake pembekuan lan pembekuan tekanan tinggi (Gambar 1a). Kita ngembangake pipa analisis gambar mitokondria otomatis kanggo ngukur wolung parameter morfologis populasi mitokondria ing telung replikasi biologis. Kita nemokake manawa perawatan PPA ngowahi papat parameter kanthi signifikan: area 2, area, perimeter, lan diameter Feret (Gambar 1b–e). Area 2 mudhun kanthi signifikan kanthi perawatan PPA 3 mM lan 5 mM (p = 0,0183 lan p = 0,002, masing-masing) (Gambar 1b), dene area (p = 0,003), perimeter (p = 0,0106) lan diameter Feret kabeh mudhun kanthi signifikan. Ana pengurangan sing signifikan (p = 0,0172) ing klompok perawatan 5 mM dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar 1c–e). Pangurangan sing signifikan ing area lan keliling nuduhake yen sel sing diobati nganggo 5 mM PPA duwe mitokondria sing luwih cilik lan luwih bunder, lan mitokondria iki kurang dawa tinimbang sing ana ing sel kontrol. Iki uga konsisten karo penurunan sing signifikan ing diameter Feret, parameter independen sing nuduhake penurunan jarak paling gedhe antarane pinggiran partikel. Owah-owahan ing ultrastruktur krista diamati: krista dadi kurang jelas ing pengaruh stres PPA (Gambar 1a, panel B). Nanging, ora kabeh gambar kanthi jelas nggambarake ultrastruktur krista, mula analisis kuantitatif saka owah-owahan kasebut ora ditindakake. Data TEM iki bisa nggambarake telung skenario sing bisa ditindakake: (1) PPA nambah fisi utawa nyegah fusi, nyebabake mitokondria sing ana saya suda; (2) biogenesis sing ditingkatake nggawe mitokondria anyar sing luwih cilik utawa (3) ngindhuksi loro mekanisme kasebut bebarengan. Sanajan kahanan kasebut ora bisa dibedakake dening TEM, owah-owahan morfologis sing signifikan nuduhake owah-owahan ing homeostasis lan dinamika mitokondria ing stres PPA. Sabanjure kita njelajah parameter tambahan kanggo luwih nggambarake dinamika kasebut lan mekanisme potensial sing ndasari.
Asam propionat (PPA) ngowahi morfologi mitokondria. (a) Gambar mikroskop elektron transmisi representatif (TEM) sing nuduhake yen ukuran mitokondria mudhun lan mitokondria dadi luwih cilik lan luwih bunder kanthi perawatan PPA sing saya tambah; 0 mM (ora diobati), 3 mM lan 5 mM. Panah abang nuduhake mitokondria. (b-e) Sel SH-SY5Y sing diobati nganggo PPA sajrone 24 jam disiapake kanggo TEM lan asil dianalisis nggunakake Fiji/ImageJ. Papat saka wolung parameter nuduhake beda sing signifikan antarane sel kontrol (ora diobati, 0 mM PPA) lan sel sing diobati (3 mM lan 5 mM PPA). (b) Wilayah 2, (c) Area, (d) Perimeter, (e) Diameter feret. Analisis varians siji arah (kontrol vs. perawatan) lan uji perbandingan ganda Dunnett digunakake kanggo nemtokake beda sing signifikan (p <0,05). Titik data makili nilai mitokondria rata-rata kanggo saben sel individu, lan garis kesalahan makili rata-rata ± SEM. Data sing dituduhake makili n = 3, paling ora 24 sel saben replikasi; total 266 gambar dianalisis; * nuduhake p < 0,05, ** nuduhake p < 0,01.
Kanggo luwih nggambarake kepiye dinamika mitokondria nanggepi PPA, kita ngewarnai mitokondria nganggo tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) lan nggunakake mikroskopi time-lapse lan analisis MEL kanggo lokalisasi lan ngitung mitokondria sawise 24 jam ing 3 lan 5 mM PPA. Perawatan kedadeyan fisi lan fusi. (Gambar 2a). Sawise analisis MEL, mitokondria dianalisis luwih lanjut kanggo ngetung jumlah struktur mitokondria lan volume rata-rata. Kita mirsani peningkatan cilik nanging signifikan ing jumlah kedadeyan fisi sing kedadeyan ing 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] dibandhingake karo fisi [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] lan fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] lan fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] kedadeyan tambah signifikan ing 5 mM dibandhingake karo kontrol (Gambar 3b). Cacahing mitokondria mundhak sacara signifikan ing 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] lan 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Gambar 3c), dene volume rata-rata saben struktur mitokondria tetep ora owah (Gambar 3c). 3d). Yen digabungake, iki nuduhake yen remodeling dinamika mitokondria dadi respon kompensasi sing kasil njaga integritas jaringan mitokondria. Peningkatan jumlah kedadeyan fisi ing 3 mM PPA nuduhake yen peningkatan jumlah mitokondria sebagian amarga fisi mitokondria, nanging amarga volume mitokondria rata-rata tetep ora owah, biogenesis ora bisa dikesampingake minangka respon kompensasi tambahan. Nanging, data kasebut konsisten karo struktur mitokondria bunder sing luwih cilik sing diamati dening TEM lan uga nuduhake owah-owahan sing signifikan ing dinamika mitokondria sing disebabake dening PPA.
Asam propionat (PPA) ngindhuksi remodeling mitokondria dinamis kanggo njaga integritas jaringan. Sel SH-SY5Y dikultur, diobati nganggo PPA 3 lan 5 mM sajrone 24 jam lan diwernani nganggo TMRE lan Hoechst 33342 banjur diterusake karo analisis MEL. (a) Gambar mikroskopi selang wektu representatif sing nggambarake warna lan proyeksi intensitas maksimum binarisasi ing wektu 2 (t2) kanggo saben kondisi. Wilayah sing dipilih sing dituduhake ing saben gambar biner ditingkatake lan ditampilake ing 3D ing telung pigura wektu sing beda (t1-t3) kanggo nggambarake dinamika sajrone wektu; kedadeyan fusi disorot nganggo warna ijo; kedadeyan fisi disorot nganggo warna ijo. Ditampilake nganggo warna abang. (b) Jumlah rata-rata kedadeyan dinamis saben kondisi. (c) Jumlah rata-rata struktur mitokondria saben sel. (d) Volume rata-rata (µm3) saben struktur mitokondria saben sel. Data sing dituduhake minangka perwakilan n = 15 sel saben klompok perawatan. Bilah kesalahan sing dituduhake makili rata-rata ± SEM, bilah skala = 10 μm, * p < 0,05.
Asam propionat (PPA) nyebabake penekanan transkripsi gen sing ana gandhengane karo dinamika mitokondria. Sel SH-SY5Y diobati nganggo 3 lan 5 mM PPA sajrone 24 jam. Kuantifikasi gen relatif ditindakake nggunakake RT-qPCR lan dinormalisasi dadi B2M. Gen biogenesis mitokondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 lan (d) NFE2L2. Gen fusi lan fisi mitokondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 lan (i) DRP1. Bedane sing signifikan (p < 0,05) dites nggunakake ANOVA siji arah (kontrol vs. perawatan) lan uji perbandingan ganda Dunnett: * nuduhake p < 0,05, ** nuduhake p < 0,01, lan **** nuduhake p < 0,0001. Batang makili ekspresi rata-rata ± SEM. Data sing dituduhake makili n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), lan n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replikasi biologis.
Data saka analisis TEM lan MEL bebarengan nuduhake yen PPA ngowahi morfologi lan dinamika mitokondria. Nanging, teknik pencitraan iki ora menehi wawasan babagan mekanisme sing ndasari proses kasebut. Mula, kita nliti ekspresi mRNA saka sangang regulator utama dinamika mitokondria, biogenesis, lan mitosis minangka respon kanggo perawatan PPA. Kita ngukur onkogen myeloma sel (cMYC), faktor pernapasan nuklir (NRF1), faktor transkripsi mitokondria 1 (TFAM), faktor transkripsi kaya NFE2 BZIP (NFE2L2), protein kaya gastrin 2 (STOML2), atrofi saraf optik 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) lan protein sing ana gandhengane karo dinamin 1 (DRP1) sawise 24 jam perawatan nganggo 3 mM lan 5 mM PPA. Kita mirsani perawatan PPA 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 lan p < 0,0001) lan 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Gambar 3a–c). Penurunan ekspresi mRNA gumantung dosis: ekspresi cMYC, NRF1 lan TFAM mudhun 5,7, 2,6 lan 1,9 kali ing 3 mM, lan 11,2, 3 lan 2,2 kali ing 5 mM. Kosok baline, gen biogenesis redoks pusat NFE2L2 ora owah ing konsentrasi PPA apa wae, sanajan tren penurunan ekspresi sing gumantung dosis uga diamati (Gambar 3d).
Kita uga nliti ekspresi gen klasik sing melu regulasi fisi lan fusi. STOML2 dianggep melu fusi, mitofagi lan biogenesis, lan ekspresine suda sacara signifikan (p < 0,0001) kanthi 3 mM (owah-owahan 2,4 kali lipat) lan 5 mM (owah-owahan 2,8 kali lipat) PPA (Gambar 1). 3d). Kajaba iku, ekspresi gen fusi OPA1 mudhun ing 3 mM (owah-owahan 1,6 kali lipat) lan 5 mM (owah-owahan 1,9 kali lipat) PPA (p = 0,006 lan p = 0,0024, masing-masing) (Gambar 3f). Nanging, kita ora nemokake bedane sing signifikan ing ekspresi gen fusi MFN1, MFN2 utawa gen fisi DRP1 ing stres PPA 24 jam (Gambar 3g–i). Kajaba iku, kita nemokake manawa tingkat papat protein fusi lan fisi (OPA1, MFN1, MFN2 lan DRP1) ora owah ing kahanan sing padha (Gambar 4a-d). Penting kanggo dicathet manawa data kasebut nggambarake siji titik wektu lan bisa uga ora nggambarake owah-owahan ing ekspresi protein utawa tingkat aktivitas sajrone tahap awal stres PPA. Nanging, pengurangan sing signifikan ing ekspresi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, lan OPA1 nuduhake disregulasi transkripsi sing signifikan saka metabolisme mitokondria, biogenesis, lan dinamika. Kajaba iku, data kasebut nyoroti kegunaan teknik pencitraan kanggo nyinaoni langsung owah-owahan kahanan pungkasan ing fungsi mitokondria.
Tingkat protein fusi lan faktor fisi ora owah sawise perawatan asam propionat (PPA). Sel SH-SY5Y diobati nganggo PPA 3 lan 5 mM sajrone 24 jam. Tingkat protein diukur nganggo analisis Western blot, lan tingkat ekspresi dinormalisasi dadi protein total. Ekspresi protein rata-rata lan Western blot representatif saka protein target lan total dituduhake. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Batang makili rata-rata ± SEM, lan data sing dituduhake makili n = 3 replikasi biologis. Perbandingan pirang-pirang (p < 0,05) ditindakake nggunakake analisis varians siji arah lan tes Dunnett. Gel lan blot asli dituduhake ing Gambar S1.
Disfungsi mitokondria ana gandheng cenenge karo penyakit multisistem wiwit saka penyakit metabolik, kardiovaskular lan otot nganti penyakit neurologis1,10. Akeh penyakit neurodegeneratif lan neurodegeneratif ana gandheng cenenge karo disfungsi mitokondria, sing nuduhake pentinge organel kasebut sajrone umur otak. Penyakit kasebut kalebu penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer lan ASD3,4,18. Nanging, akses menyang jaringan otak kanggo nyinaoni penyakit kasebut angel, utamane ing tingkat mekanistik, saengga sistem model seluler dadi alternatif sing dibutuhake. Ing panliten iki, kita nggunakake sistem model seluler sing nggunakake sel SH-SY5Y sing diobati PPA kanggo ngringkes disfungsi mitokondria sing diamati ing penyakit neuronal, utamane kelainan spektrum autisme. Nggunakake model PPA iki kanggo nyinaoni dinamika mitokondria ing neuron bisa menehi wawasan babagan etiologi ASD.
Kita njelajah kemungkinan nggunakake TEM kanggo ndeleng owah-owahan ing morfologi mitokondria. Penting kanggo dicathet yen TEM kudu digunakake kanthi bener kanggo ngoptimalake efektifitase. Persiapan spesimen krio ngidini pengawetan struktur neuronal sing luwih apik kanthi ndandani komponen seluler lan nyuda pembentukan artefak34. Konsisten karo iki, kita mirsani yen sel SH-SY5Y kaya neuron duwe organel subselular sing utuh lan mitokondria sing dawa (Gambar 1a). Iki nyoroti kegunaan teknik persiapan kriogenik kanggo nyinaoni morfologi mitokondria ing model sel neuronal. Sanajan pangukuran kuantitatif penting banget kanggo analisis objektif data TEM, isih durung ana konsensus babagan parameter tartamtu sing kudu diukur kanggo ngonfirmasi owah-owahan morfologis mitokondria. Adhedhasar akeh panliten sing wis nliti morfologi mitokondria kanthi kuantitatif17,31,32, kita ngembangake pipa analisis gambar mitokondria otomatis sing ngukur wolung parameter morfologis, yaiku: area, area2, rasio aspek, keliling, sirkularitas, derajat, diameter Feret, lan kebulatan.
Antarane, PPA nyuda area 2, area, perimeter, lan diameter Feret kanthi signifikan (Gambar 1b-e). Iki nuduhake yen mitokondria dadi luwih cilik lan luwih bunder, sing konsisten karo panliten sadurunge sing nuduhake penurunan area mitokondria sawise 72 jam stres mitokondria sing diinduksi PPA30. Fitur morfologis iki bisa nuduhake fisi mitokondria, proses sing dibutuhake kanggo nyingkirake komponen sing rusak saka jaringan mitokondria kanggo ningkatake degradasi liwat mitophagy35,36,37. Ing sisih liya, penurunan ukuran mitokondria rata-rata bisa uga ana gandhengane karo peningkatan biogenesis, sing nyebabake pembentukan mitokondria cilik sing lagi wae lair. Peningkatan fisi utawa biogenesis minangka respon kompensasi kanggo njaga mitosis nglawan stres mitokondria. Nanging, penurunan pertumbuhan mitokondria, fusi sing cacat, utawa kondisi liyane ora bisa dikesampingake.
Sanajan gambar resolusi dhuwur sing digawe dening TEM ngidini nemtokake karakteristik morfologis ing tingkat mitokondria individu, metode iki ngasilake snapshot rong dimensi ing siji titik wektu. Kanggo nyinaoni respon dinamis kanggo stres metabolik, kita ngewarnai mitokondria nganggo TMRE lan nggunakake mikroskopi selang wektu kanthi analisis MEL, sing ngidini visualisasi 3D throughput dhuwur saka owah-owahan ing jaringan mitokondria sajrone wektu33,38. Kita mirsani owah-owahan sing alus nanging signifikan ing dinamika mitokondria ing stres PPA (Gambar 2). Ing 3 mM, jumlah kedadeyan fisi tambah akeh, dene kedadeyan fusi tetep padha karo kontrol. Peningkatan jumlah kedadeyan fisi lan fusi diamati ing 5 mM PPA, nanging owah-owahan kasebut kira-kira proporsional, sing nuduhake yen kinetika fisi lan fusi tekan keseimbangan ing konsentrasi sing luwih dhuwur (Gambar 2b). Volume mitokondria rata-rata tetep ora owah ing 3 lan 5 mM PPA, sing nuduhake yen integritas jaringan mitokondria tetep dijaga (Gambar 2d). Iki nuduhake kemampuan jaringan mitokondria dinamis kanggo nanggapi stres metabolik entheng kanggo njaga homeostasis kanthi efektif tanpa nyebabake fragmentasi jaringan. Ing 3 mM PPA, paningkatan fisi cukup kanggo ningkatake transisi menyang keseimbangan anyar, nanging remodeling kinetik sing luwih jero dibutuhake minangka respon kanggo stres sing disebabake dening konsentrasi PPA sing luwih dhuwur.
Cacahing mitokondria mundhak ing loro konsentrasi stres PPA, nanging volume mitokondria rata-rata ora owah sacara signifikan (Gambar 2c). Iki bisa uga amarga tambahing biogenesis utawa tambahing divisi; Nanging, tanpa ana penurunan volume mitokondria rata-rata sing signifikan, luwih cenderung biosintesis mundhak. Nanging, data ing Gambar 2 ndhukung anane rong mekanisme kompensasi: tambahing jumlah kedadeyan fisi, konsisten karo upregulasi fisi mitokondria, lan tambahing jumlah kedadeyan, konsisten karo biogenesis mitokondria. Pungkasane, kompensasi dinamis kanggo stres entheng bisa uga kalebu proses simultan sing nglibatake fisi, fusi, biogenesis, lan mitofagi. Sanajan penulis sadurunge wis nuduhake yen PPA nambah mitosis30,39 lan mitofagi29, kita nyedhiyakake bukti kanggo remodeling dinamika fisi lan fusi mitokondria minangka respon kanggo PPA. Data kasebut ngonfirmasi owah-owahan morfologis sing diamati dening TEM lan menehi wawasan luwih lanjut babagan mekanisme sing ana gandhengane karo disfungsi mitokondria sing diinduksi PPA.
Amarga analisis TEM utawa MEL ora menehi bukti langsung babagan mekanisme pangaturan gen sing ndasari owah-owahan morfologis sing diamati, kita nliti ekspresi RNA gen sing melu metabolisme mitokondria, biogenesis, lan dinamika. Proto-onkogen cMYC minangka faktor transkripsi sing melu regulasi mitokondria, glikolisis, asam amino lan metabolisme asam lemak40. Kajaba iku, cMYC dikenal ngatur ekspresi meh 600 gen mitokondria sing melu transkripsi, translasi, lan perakitan kompleks mitokondria, kalebu NRF1 lan TFAM41. NRF1 lan TFAM minangka rong regulator pusat mitosis, sing tumindak ing sisih hilir PGC-1α kanggo ngaktifake replikasi mtDNA. Jalur iki diaktifake dening sinyal cAMP lan AMPK lan sensitif marang pengeluaran energi lan stres metabolik. Kita uga nliti NFE2L2, regulator redoks biogenesis mitokondria, kanggo nemtokake manawa efek PPA bisa dimediasi dening stres oksidatif.
Sanajan ekspresi NFE2L2 tetep ora owah, kita nemokake penurunan ekspresi cMYC, NRF1, lan TFAM sing konsisten gumantung dosis sawise 24 jam perawatan nganggo 3 mM lan 5 mM PPA (Gambar 3a-c). Downregulation ekspresi cMYC sadurunge wis dilapurake minangka respon kanggo stres mitokondria42, lan kosok baline, downregulation ekspresi cMYC bisa nyebabake disfungsi mitokondria kanthi ngowahi metabolisme mitokondria, konektivitas jaringan, lan polarisasi membran43. Menariknya, cMYC uga melu regulasi fisi lan fusi mitokondria42,43 lan dikenal nambah fosforilasi DRP1 lan lokalisasi mitokondria sajrone divisi sel44, uga mediasi remodeling morfologis mitokondria ing sel punca neuronal45. Pancen, fibroblas sing kekurangan cMYC nuduhake ukuran mitokondria sing suda, konsisten karo owah-owahan sing disebabake dening stres PPA43. Data kasebut nggambarake hubungan sing menarik nanging durung jelas antarane cMYC lan dinamika mitokondria, nyedhiyakake target sing menarik kanggo studi mbesuk babagan remodeling sing disebabake stres PPA.
Pangurangan NRF1 lan TFAM konsisten karo peran cMYC minangka aktivator transkripsi sing penting. Data iki uga konsisten karo panliten sadurunge ing sel kanker usus besar manungsa sing nuduhake yen PPA nyuda ekspresi mRNA NRF1 ing 22 jam, sing ana gandhengane karo penipisan ATP lan nambah ROS46. Para penulis iki uga nglaporake yen ekspresi TFAM mundhak ing 8,5 jam nanging bali menyang tingkat garis dasar ing 22 jam. Kosok baline, Kim et al. (2019) nuduhake yen ekspresi mRNA TFAM mudhun sacara signifikan sawise 4 jam stres PPA ing sel SH-SY5Y; Nanging, sawise 72 jam, ekspresi protein TFAM mundhak sacara signifikan lan jumlah salinan mtDNA mundhak sacara signifikan. Dadi, penurunan jumlah gen biogenesis mitokondria sing diamati sawise 24 jam ora ngilangi kemungkinan yen paningkatan jumlah mitokondria ana gandhengane karo aktivasi biogenesis ing titik wektu sadurunge. Panliten sadurunge nuduhake yen PPA sacara signifikan ningkatake mRNA lan protein PGC-1α ing sel SH-SY5Y sajrone 4 jam 30 menit, dene asam propionat nambah biogenesis mitokondria ing hepatosit pedhet liwat PGC-1α sajrone 12 jam 39 menit. Menariknya, PGC-1α ora mung regulator transkripsi langsung NRF1 lan TFAM, nanging uga wis dituduhake ngatur aktivitas MFN2 lan DRP1 kanthi ngatur fisi lan fusi47. Digabungake, iki nyoroti gandhengan mekanisme sing raket sing ngatur respon kompensasi mitokondria sing disebabake dening PPA. Kajaba iku, data kita nuduhake disregulasi sing signifikan saka regulasi transkripsi biogenesis lan metabolisme ing stres PPA.
Gen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 lan DRP1 kalebu regulator pusat fisi, fusi, lan dinamika mitokondria37,48,49. Ana akeh gen liyane sing melu dinamika mitokondria, nanging, STOML2, OPA1 lan MFN2 sadurunge ditemokake dimetilasi kanthi beda ing kohort ASD,16 lan sawetara panliten independen wis nglaporake owah-owahan ing faktor transkripsi kasebut minangka respon kanggo stres mitokondria50,51.52. Ekspresi OPA1 lan STOML2 dikurangi sacara signifikan kanthi perawatan PPA 3 mM lan 5 mM (Gambar 3e, f). OPA1 minangka salah sawijining regulator klasik fusi mitokondria liwat interaksi langsung karo MFN1 lan 2 lan nduweni peran ing remodeling krista lan morfologi mitokondria53. Peran tepat STOML2 ing dinamika mitokondria isih durung jelas, nanging bukti nuduhake yen nduweni peran ing fusi mitokondria, biogenesis, lan mitofagi.
STOML2 melu njaga gandhengan pernapasan mitokondria lan pembentukan kompleks rantai pernapasan54,55 lan wis dituduhake bisa ngowahi karakteristik metabolisme sel kanker kanthi jero56. Panliten nuduhake yen STOML2 ningkatake potensial membran mitokondria lan biogenesis liwat interaksi karo BAN lan cardiolipin55, 57, 58. Kajaba iku, panliten independen nuduhake yen interaksi antarane STOML2 lan PINK1 ngatur mitophagy59,60. Khususé, STOML2 wis dilaporake langsung sesambungan karo lan nyetabilake MFN2 lan uga nduweni peran penting kanggo nyetabilake isoform OPA1 sing dawa kanthi nyegah protease sing tanggung jawab kanggo degradasi OPA153,61,62. Penurunan ekspresi STOML2 sing diamati ing reaksi PPA bisa nggawe protein fusi iki luwih rentan marang degradasi liwat jalur sing gumantung karo ubiquitin lan proteasom48. Senajan peran tepat STOML2 lan OPA1 ing respon dinamis marang PPA durung jelas, penurunan ekspresi gen fusi iki (Gambar 3) bisa ngganggu keseimbangan antarane fisi lan fusi lan nyebabake penurunan ukuran mitokondria (Gambar 3). 1).
Ing sisih liya, ekspresi protein OPA1 tetep ora owah sawise 24 jam, dene tingkat mRNA lan protein MFN1, MFN2 utawa DRP1 ora owah sacara signifikan sawise perawatan PPA (Gambar 3g-i, Gambar 4). Iki bisa uga nuduhake yen ora ana owah-owahan ing regulasi faktor-faktor kasebut sing ana gandhengane karo fusi lan fisi mitokondria. Nanging, perlu dicathet yen saben papat gen iki uga diatur dening modifikasi posttranscriptional (PTM) sing ngontrol aktivitas protein. OPA1 duwe wolung varian sambatan alternatif sing dibelah sacara proteolitik ing mitokondria kanggo ngasilake rong isoform sing beda 63. Keseimbangan antarane isoform dawa lan cendhak pungkasane nemtokake peran OPA1 ing fusi mitokondria lan pangopènan jaringan mitokondria 64. Aktivitas DRP1 diatur dening fosforilasi protein kinase II (CaMKII) sing gumantung kalsium/kalmodulin, dene degradasi DRP1 diatur dening ubiquitination lan SUMOylation 65. Pungkasanipun, DRP1 lan MFN1/2 minangka GTPase, saengga aktivitas kasebut bisa dipengaruhi dening tingkat produksi GTP ing mitokondria 66. Mulane, sanajan ekspresi protein kasebut tetep konstan, iki bisa uga ora nuduhake aktivitas protein utawa lokalisasi sing ora owah 67,68. Pancen, repertoar protein PTM sing ana asring dadi garis pertahanan pertama sing tanggung jawab kanggo mediasi respon stres akut. Ing ngarsane stres metabolik moderat ing model kita, kemungkinan PTM ningkatake aktivitas protein fusi lan fisi sing tambah kanggo mulihake integritas mitokondria kanthi cukup tanpa mbutuhake aktivasi tambahan gen kasebut ing tingkat mRNA utawa protein.
Yen digabungake, data ing ndhuwur nyoroti regulasi morfologi mitokondria sing kompleks lan gumantung wektu lan tantangan kanggo njlentrehake mekanisme kasebut. Kanggo nyinaoni ekspresi gen, luwih dhisik perlu ngenali gen target tartamtu ing jalur kasebut. Nanging, data kita nuduhake yen gen ing jalur sing padha ora nanggapi kanthi cara sing padha kanggo stres sing padha. Nyatane, panliten sadurunge wis nuduhake yen gen sing beda ing jalur sing padha bisa uga nuduhake profil respon temporal sing beda30,46. Kajaba iku, ana mekanisme pasca-transkripsi sing kompleks sing ngganggu hubungan antarane transkripsi lan fungsi gen. Panliten proteomik bisa menehi wawasan babagan dampak PTM lan fungsi protein, nanging uga menehi tantangan kalebu metode throughput sing kurang, rasio signal-to-noise sing dhuwur, lan resolusi sing kurang apik.
Ing konteks iki, nyinaoni morfologi mitokondria nggunakake TEM lan MEL nduweni potensi gedhe kanggo njawab pitakonan dhasar babagan hubungan antarane dinamika lan fungsi mitokondria lan kepiye iki mengaruhi penyakit. Sing paling penting, TEM nyedhiyakake metode langsung kanggo ngukur morfologi mitokondria minangka titik pungkasan konvergen saka disfungsi lan dinamika mitokondria51. MEL uga nyedhiyakake metode langsung kanggo nggambarake kedadeyan fisi lan fusi ing lingkungan seluler telung dimensi, sing ngidini kuantifikasi remodeling mitokondria dinamis sanajan ora ana owah-owahan ing ekspresi gen33. Ing kene kita nyoroti kegunaan teknik pencitraan mitokondria ing penyakit mitokondria sekunder. Penyakit kasebut biasane ditondoi dening stres metabolik entheng kronis sing ditondoi dening remodeling jaringan mitokondria sing alus tinimbang kerusakan mitokondria akut. Nanging, kompensasi mitokondria sing dibutuhake kanggo njaga mitosis ing stres kronis nduweni akibat fungsional sing jero. Ing konteks neurosains, pangerten sing luwih apik babagan mekanisme kompensasi iki bisa menehi informasi penting babagan neuropatologi pleiotropik sing ana gandhengane karo disfungsi mitokondria.
Pungkasanipun, data kita nyoroti kegunaan teknik pencitraan kanggo mangerteni akibat fungsional saka interaksi kompleks antarane ekspresi gen, modifikasi protein, lan aktivitas protein sing ngontrol dinamika mitokondria neuronal. Kita nggunakake PPA kanggo model disfungsi mitokondria ing model sel neuronal kanggo entuk wawasan babagan komponen mitokondria ASD. Sel SH-SY5Y sing diobati nganggo PPA nuduhake owah-owahan ing morfologi mitokondria: mitokondria dadi cilik lan bunder, lan krista ora jelas nalika diamati dening TEM. Analisis MEL nuduhake yen owah-owahan kasebut kedadeyan bebarengan karo peningkatan kedadeyan fisi lan fusi kanggo njaga jaringan mitokondria minangka respon kanggo stres metabolik entheng. Kajaba iku, PPA ngganggu regulasi transkripsi metabolisme lan homeostasis mitokondria kanthi signifikan. Kita ngidentifikasi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, lan OPA1 minangka regulator mitokondria utama sing diganggu dening stres PPA lan bisa uga nduweni peran ing mediasi owah-owahan sing diinduksi PPA ing morfologi lan fungsi mitokondria. Panliten ing mangsa ngarep dibutuhake kanggo menehi ciri sing luwih apik babagan owah-owahan temporal sing diinduksi PPA ing ekspresi gen lan aktivitas protein, lokalisasi, lan modifikasi pasca-translasi. Data kita nyoroti kerumitan lan saling ketergantungan mekanisme pengaturan sing dadi mediator respon stres mitokondria lan nduduhake kegunaan TEM lan teknik pencitraan liyane kanggo studi mekanistik sing luwih tertarget.
Garis sel SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) dituku saka Sigma-Aldrich. Sel SH-SY5Y ditumbuhake ing campuran nutrisi medium/F-12 Eagle sing dimodifikasi Dulbecco (DMEM/F-12) lan L-glutamin (SC09411, ScienCell) ing labu 25 cm2 sing ditambah karo 20% serum sapi janin (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) lan 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ing suhu 37 °C, 5% CO2. Sel disubkultur nganti 80% konfluensi nggunakake 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), disentrifugasi ing 300 g lan dilapisi kanthi kapadhetan kira-kira 7 × 105 sel/ml. Kabeh eksperimen ditindakake ing sel SH-SY5Y sing durung terdiferensiasi antarane passage 19–22. PPA diwenehake minangka NaP. Larutake bubuk NaP (CAS No. 137-40-6, rumus kimia C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ing banyu MilliQ anget nganti konsentrasi 1 M lan simpen ing suhu 4 °C. Ing dina perawatan, encerake larutan iki nganggo 1 M PPA nganti 3 mM lan 5 mM PPA ing medium bebas serum (DMEM/F-12 nganggo L-glutamin). Konsentrasi perawatan kanggo kabeh eksperimen yaiku ora ana PPA (0 mM, kontrol), 3 mM, lan 5 mM PPA. Eksperimen ditindakake paling ora ing telung replikasi biologis.
Sel SH-SY5Y diwiji menyang labu 25 cm5 kanthi laju 5,5 × 105 sel/ml lan ditumbuhake sajrone 24 jam. Perawatan PPA ditambahake menyang labu sadurunge inkubasi 24 jam. Kumpulake pelet sel miturut protokol subkultur jaringan mamalia normal (dijelasake ing ndhuwur). Suspensikake maneh pelet sel ing 100 µl 2,5% glutaraldehida, 1× PBS lan simpen ing suhu 4 °C nganti diproses. Sel SH-SY5Y disentrifugasi sedhela kanggo nggawe pelet sel lan mbusak larutan 2,5% glutaraldehida, 1× PBS. Suspensikake maneh sedimen ing gel agarose 4% sing disiapake ing banyu suling (rasio volume agarose karo sedimen yaiku 1:1). Potongan agarose diselehake ing kisi-kisi ing piring datar lan dilapisi karo 1-heksadesen sadurunge pembekuan tekanan tinggi. Sampel dibekukan ing 100% aseton garing ing -90°C sajrone 24 jam. Suhu banjur diunggahake dadi -80°C lan larutan 1% osmium tetroksida lan 0,1% glutaraldehida ditambahake. Sampel disimpen ing suhu -80°C sajrone 24 jam. Sawise iki, suhu kasebut ditambah kanthi bertahap nganti suhu ruangan sajrone sawetara dina: saka –80 °C nganti –50 °C sajrone 24 jam, nganti –30 °C sajrone 24 jam, nganti –10 °C sajrone 24 jam lan pungkasane nganti suhu ruangan.
Sawisé persiapan kriogenik, sampel diresapi resin lan potongan ultra tipis (∼100 nm) digawe nggunakake ultramicrotome Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Potongan-potongan kasebut diwernani nganggo uranil asetat 2% lan timbal sitrat. Sampel diamati nggunakake mikroskop elektron transmisi FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (biyen FEI), Eindhoven, Walanda) sing beroperasi ing 200 kV (pemancar Lab6) lan kamera CCD Gatan (Gatan, Inggris) sing dilengkapi filter energi Tridiem.
Ing saben replikasi teknis, paling ora 24 gambar sel tunggal dipikolehi, kanthi total 266 gambar. Kabeh gambar dianalisis nggunakake makro Wilayah Minat (ROI) lan makro Mitokondria. Makro mitokondria adhedhasar metode sing diterbitake17,31,32 lan ngidini pamrosesan batch semi-otomatis gambar TEM ing Fiji/ImageJ69. Cekakipun: gambar kasebut diwalik lan dibalik nggunakake pengurangan latar mburi bal gulung (radius 60 piksel) lan filter bandpass FFT (nggunakake wates ndhuwur lan ngisor 60 lan 8 piksel) lan penekanan garis vertikal kanthi toleransi orientasi 5%. Gambar sing diproses kanthi otomatis diwatesi nggunakake algoritma entropi maksimum lan topeng biner digawe. Wilayah gambar sing ana gandhengane karo ROI sing dipilih kanthi manual ing gambar TEM mentah diekstrak, menehi ciri mitokondria lan ora kalebu membran plasma lan wilayah kontras dhuwur liyane. Kanggo saben ROI sing diekstrak, partikel biner sing luwih gedhe tinimbang 600 piksel dianalisis, lan area partikel, keliling, sumbu mayor lan minor, diameter Feret, kebulatan, lan sirkularitas diukur nggunakake fungsi pangukuran bawaan Fiji/ImageJ. Sawise Merrill, Flippo, lan Strack (2017), area 2, rasio aspek partikel (rasio sumbu mayor menyang minor), lan faktor bentuk (FF) diitung saka data kasebut, ing ngendi FF = keliling 2/4pi x area. Definisi rumus parametrik bisa ditemokake ing Merrill, Flippo, lan Strack (2017). Makro sing kasebut kasedhiya ing GitHub (waca Pernyataan Ketersediaan Data). Rata-rata, kira-kira 5.600 partikel dianalisis saben perawatan PPA, kanthi total kira-kira 17.000 partikel (data ora ditampilake).
Sel SH-SH5Y diselehake ing piring kultur 8-ruang (ThermoFisher, #155411) kanggo ngidini adhesi sewengi banjur diinkubasi karo TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) lan Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). pewarnaan. Gambar dijupuk nggunakake laser 405 nm lan 561 nm sajrone lingkungan 10 menit, lan gambar mentah dijupuk minangka tumpukan-z sing ngemot 10 mikrograf gambar kanthi langkah az 0,2 μm antarane pigura gambar ing 12 titik wektu sabanjure. Gambar dikumpulake nggunakake platform resolusi super Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) nggunakake lensa LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Gambar dianalisis ing ImageJ nggunakake pipeline sing wis diterangake sadurunge lan plugin ImageJ kanggo ngukur kedadeyan fusi lan fisi, jumlah rata-rata struktur mitokondria, lan volume mitokondria rata-rata saben sel33. Makro MEL kasedhiya ing GitHub (waca Pernyataan Kasedhiyan Data).
Sel SH-SY5Y ditumbuhake ing piring enem sumur kanthi kapadhetan 0,3 × 106 sel/mL sajrone 24 jam sadurunge perawatan. RNA diekstrak nggunakake protokol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) kanthi modifikasi sithik: tambahake 300 μl buffer lisis RNA menyang saben sumur sadurunge dicopot lan lisis saben sampel minangka langkah pungkasan nganggo 30 μl elusi DNase/RNase. -banyu bebas. Kabeh sampel dicenthang jumlah lan kualitas nggunakake Spektrofotometer UV-Vis NanoDrop ND-1000. Total protein saka lisat sel dipikolehi nggunakake 200 μl buffer lisis RIPA, lan konsentrasi protein diukur nggunakake uji protein Bradford70.
Sintesis cDNA ditindakake nggunakake Kit Sintesis cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) miturut pandhuan pabrikan kanthi sawetara modifikasi. cDNA disintesis ing reaksi 20-μl nggunakake 0,7 nganti 1 μg total RNA. Primer dipilih saka makalah sing wis diterbitake sadurunge 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) lan probe sing diiringi dirancang nggunakake alat PrimerQuest saka Integrated DNA Technologies. Kabeh gen sing disenengi dinormalisasi menyang gen B2M nuklir. Ekspresi gen STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC lan OPA1 diukur nganggo RT-qPCR. Campuran master kalebu LUNA Taq polimerase (M3003L, New England Biolabs), primer maju lan mundur 10 μM, cDNA, lan banyu kelas PCR kanggo ngasilake volume pungkasan 10 μL kanggo saben reaksi. Ekspresi gen divisi lan fisi (DRP1, MFN1/2) diukur nggunakake uji multipleks TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) digunakake miturut pandhuan pabrikan kanthi modifikasi cilik. Campuran master RT-qPCR multipleks kalebu 1X LUNA Taq polimerase, primer maju lan mundur 10 μM, probe 10 μM, cDNA, lan banyu kelas PCR, sing ngasilake volume pungkasan 20 μL kanggo saben reaksi. RT-qPCR ditindakake nggunakake Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nomer seri: R0618110). Kondisi siklus dituduhake ing Tabel S1. Kabeh sampel cDNA diamplifikasi kanthi rangkap telu lan kurva standar digawe nggunakake seri pengenceran sepuluh kali lipat. Outlier ing sampel rangkap telu kanthi ambang siklus standar deviasi (Ct) >0,5 dibusak saka analisis kanggo njamin reproduksibilitas data30,72. Ekspresi gen relatif diitung nggunakake metode 2-ΔΔCt79.
Sampel protein (60 μg) dicampur karo buffer loading Laemmli kanthi rasio 2:1 lan dilakokake ing gel protein tanpa warna 12% (Bio-Rad #1610184). Protein ditransfer menyang membran PVDF (polivinilidena fluorida) (#170-84156, Bio-Rad) nggunakake sistem Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membran kasebut diblokir lan diinkubasi karo antibodi primer sing cocog (OPA1, MFN1, MFN2, lan DRP1) (diencerke 1:1000) sajrone 48 jam, banjur inkubasi karo antibodi sekunder (1:10.000) sajrone 1 jam. Membran banjur dicitra nggunakake Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) lan direkam nggunakake sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versi 6.1 digunakake kanggo analisis Western blot. Gel lan blot asli dituduhake ing Gambar S1. Informasi antibodi diwenehake ing Tabel S2.
Set data ditampilake minangka rata-rata lan kesalahan standar saka rata-rata (SEM) saka paling ora telung sampel independen. Set data diuji normalitas nggunakake uji Shapiro-Wilks (kajaba kasebut liya) sadurunge nganggep distribusi Gaussian lan standar deviasi sing padha lan nerusake analisis. Saliyane nganalisis set data nggunakake Fisher's MEL LSD (p < 0,05), ANOVA siji arah (rata-rata perawatan vs. kontrol), lan uji perbandingan ganda Dunnett kanggo nemtokake signifikansi (p < 0,05). Nilai p sing signifikan dituduhake ing grafik minangka *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Kabeh analisis statistik lan grafik ditindakake lan digawe nggunakake GraphPad Prism 9.4.0.
Makro Fiji/ImageJ kanggo analisis gambar TEM kasedhiya kanggo umum ing GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) kasedhiya kanggo umum ing GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM lan Vijaya A. Mitokondria: regulator utama metabolisme, homeostasis, stres, penuaan lan epigenetik. Indonesia. Ilmu Biomedis. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfungsi mitokondria multifaset ing skizofrenia, kompleks I minangka target patologis sing bisa ditindakake. Skizofrenia. sumber daya. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. lan Beal, MF Disfungsi mitokondria ing penyakit Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG lan Mehta V. Mitokondria sing stres: target invasi ing penyakit Alzheimer. Mitokondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF lan Ferreira GK Mitokondria lan otak: bioenergetika lan liya-liyane. Neurotoksin. sumber daya. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondria pleiotropik: dampak mitokondria marang perkembangan neuronal lan penyakit. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. lan Morais, VA Biogenesis mitokondria ing neuron: kepiye lan ing ngendi. internasionalitas. J. Mohr. ilmu pengetahuan. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. lan Zhao, J. Regulasi dinamika mitokondria mamalia: kesempatan lan tantangan. ngarep. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. lan Slack, RS Dinamika mitokondria ing regulasi neurogenesis: saka perkembangan otak nganti diwasa. perkembangan. dinamis. 247, 47–53 (2018).