Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Nanopartikel insulin (NP) kanthi kandungan pemuatan dhuwur wis nemokake aplikasi sing beda-beda ing macem-macem bentuk dosis. Karya iki tujuane kanggo ngevaluasi efek proses pengeringan beku lan pengeringan semprot ing struktur nanopartikel kitosan sing diisi insulin, nganggo utawa tanpa manitol minangka krioprotektan. Kita uga ngevaluasi kualitas nanopartikel kasebut kanthi nglarutake maneh. Sadurunge dehidrasi, ukuran partikel nanopartikel kitosan/natrium tripolifosfat/insulin sing diikat silang dioptimalake dadi 318 nm, PDI yaiku 0,18, efisiensi enkapsulasi yaiku 99,4%, lan pemuatan yaiku 25,01%. Sawise direkonstitusi, kabeh nanopartikel, kajaba sing diprodhuksi kanthi metode pengeringan beku tanpa nggunakake manitol, njaga struktur partikel sferis. Dibandhingake karo nanopartikel sing ngemot manitol sing didehidrasi kanthi semprotan, nanopartikel sing dikeringake semprotan bebas manitol uga nuduhake ukuran partikel rata-rata paling cilik (376 nm) lan kandungan pemuatan paling dhuwur. (25,02%) kanthi tingkat enkapsulasi sing padha (98,7%) lan PDI (0,20) kanthi teknik pangatusan utawa pangatusan beku. Nanopartikel sing dikeringake kanthi pangatusan semprot tanpa manitol uga ngasilake pelepasan insulin paling cepet lan efisiensi serapan seluler paling dhuwur. Karya iki nuduhake yen pangatusan semprot bisa ngeringake nanopartikel insulin tanpa butuh krioprotektan dibandhingake karo metode pangatusan beku konvensional, nggawe kapasitas pemuatan sing luwih gedhe, syarat aditif sing luwih murah lan biaya operasi kauntungan sing signifikan.
Wiwit ditemokake ing taun 19221,2,3, insulin lan preparat farmasine wis nylametake nyawa pasien diabetes tipe 1 (T1DM) lan diabetes tipe 2 (T1DM). Nanging, amarga sipate minangka protein kanthi bobot molekul dhuwur, insulin gampang dikumpulake, dipecah dening enzim proteolitik, lan diilangi kanthi efek first-pass. Wong sing didiagnosis diabetes tipe 1 butuh injeksi insulin sajrone uripe. Akeh pasien sing wiwitane didiagnosis diabetes tipe 2 uga mbutuhake injeksi insulin jangka panjang. Injeksi insulin saben dina minangka sumber nyeri lan rasa ora nyaman saben dina kanggo wong-wong iki, kanthi efek negatif kanggo kesehatan mental. Akibate, bentuk administrasi insulin liyane sing nyebabake rasa ora nyaman sing luwih sithik, kayata administrasi insulin oral, lagi ditliti kanthi ekstensif5 amarga nduweni potensi kanggo mulihake kualitas urip kira-kira 5 milyar wong sing nandhang diabetes ing saindenging jagad.
Teknologi nanopartikel wis nyedhiyakake kemajuan sing signifikan ing upaya kanggo njupuk insulin oral4,6,7. Teknologi sing efektif ngenkapsulasi lan nglindhungi insulin saka degradasi kanggo pangiriman sing ditargetake menyang situs awak tartamtu. Nanging, panggunaan formulasi nanopartikel duwe sawetara watesan, utamane amarga masalah stabilitas suspensi partikel. Sawetara agregasi bisa kedadeyan sajrone panyimpenan, sing nyuda bioavailabilitas nanopartikel sing dimuat insulin8. Kajaba iku, stabilitas kimia matriks polimer nanopartikel lan insulin uga kudu ditimbang kanggo njamin stabilitas nanopartikel insulin (NP). Saiki, teknologi pengeringan beku minangka standar emas kanggo nggawe NP sing stabil nalika nyegah owah-owahan sing ora dikarepake sajrone panyimpenan9.
Nanging, pangatusan beku mbutuhake tambahan krioprotektan kanggo nyegah struktur sferis NP kena pengaruh stres mekanik kristal es. Iki nyuda beban nanopartikel insulin kanthi signifikan sawise liofilisasi, amarga krioprotektan ngenggoni sebagian besar rasio bobot. Mulane, NP insulin sing diasilake asring ditemokake ora cocog kanggo nggawe formulasi bubuk garing, kayata tablet oral lan film oral, amarga butuh nanopartikel garing sing akeh kanggo entuk jendela terapeutik insulin.
Pangeringan semprotan minangka proses skala industri sing kondhang lan murah kanggo ngasilake bubuk garing saka fase cair ing industri farmasi10,11. Kontrol proses pembentukan partikel ngidini enkapsulasi sing tepat saka sawetara senyawa bioaktif12, 13. Salajengipun, iki wis dadi teknik sing efektif kanggo nyiapake protein sing dienkapsulasi kanggo administrasi oral. Sajrone pangeringan semprotan, banyu nguap kanthi cepet banget, sing mbantu njaga suhu inti partikel tetep rendah11,14, sing ngidini aplikasi kanggo ngenkapsulasi komponen sing sensitif panas. Sadurunge pangeringan semprotan, bahan lapisan kudu dihomogenisasi kanthi tliti karo larutan sing ngemot bahan sing dienkapsulasi11,14. Ora kaya pangeringan beku, homogenisasi sadurunge enkapsulasi ing pangeringan semprotan nambah efisiensi enkapsulasi sajrone dehidrasi. Amarga proses enkapsulasi pangeringan semprotan ora mbutuhake krioprotektan, pangeringan semprotan bisa digunakake kanggo ngasilake NP garing kanthi isi pemuatan sing dhuwur.
Panliten iki nglaporake produksi NP sing dimuat insulin kanthi cross-linking kitosan lan natrium tripolifosfat nggunakake metode gel ion. Gelasi ion minangka metode persiapan sing ngidini produksi nanopartikel liwat interaksi elektrostatik antarane rong spesies ionik utawa luwih ing kahanan tartamtu. Teknik pengeringan beku lan pengeringan semprot digunakake kanggo ngeringake nanopartikel cross-linked kitosan/natrium tripolifosfat/insulin sing dioptimalake. Sawise dehidrasi, morfologi dianalisis dening SEM. Kemampuan rekombinasi dievaluasi kanthi ngukur distribusi ukuran, muatan permukaan, PDI, efisiensi enkapsulasi, lan konten pemuatan. Kualitas nanopartikel sing dilarutake maneh sing diasilake kanthi metode dehidrasi sing beda uga dievaluasi kanthi mbandhingake perlindungan insulin, perilaku pelepasan, lan efektifitas serapan seluler.
pH larutan campuran lan rasio kitosan lan insulin minangka rong faktor kunci sing mengaruhi ukuran partikel lan efisiensi enkapsulasi (EE) saka NP pungkasan, amarga langsung mengaruhi proses gelasi ionotropik. pH larutan campuran dituduhake berkorelasi banget karo ukuran partikel lan efisiensi enkapsulasi (Gambar 1a). Kaya sing dituduhake ing Gambar 1a, nalika pH mundhak saka 4,0 dadi 6,0, ukuran partikel rata-rata (nm) mudhun lan EE mundhak sacara signifikan, dene nalika pH mundhak dadi 6,5, ukuran partikel rata-rata wiwit mundhak lan EE tetep ora owah. Nalika rasio kitosan karo insulin mundhak, ukuran partikel rata-rata uga mundhak. Salajengipun, ora ana owah-owahan ing EE sing diamati nalika nanopartikel disiapake kanthi rasio massa kitosan/insulin sing luwih dhuwur tinimbang 2,5:1 (w/w) (Gambar 1b). Mulane, kondisi persiapan optimal ing panliten iki (pH 6,0, rasio massa kitosan/insulin 2,5:1) digunakake kanggo Nyiapake nanopartikel sing diisi insulin kanggo panliten luwih lanjut. Ing kahanan persiapan iki, ukuran partikel rata-rata nanopartikel insulin dioptimalake dadi 318 nm (Gambar 1c), PDI yaiku 0,18, efisiensi penyisipan yaiku 99,4%, potensial zeta yaiku 9,8 mv, lan pemuatan insulin yaiku 25,01% (m/m). Adhedhasar asil mikroskop elektron transmisi (TEM), nanopartikel sing dioptimalake kira-kira bunder lan diskrit kanthi ukuran sing relatif seragam (Gambar 1d).
Optimalisasi parameter nanopartikel insulin: (a) efek pH ing diameter rata-rata lan efisiensi enkapsulasi (EE) nanopartikel insulin (disiapake kanthi rasio massa 5:1 kitosan lan insulin); (b) kitosan lan Pengaruh rasio massa insulin ing diameter rata-rata lan efisiensi enkapsulasi (EE) NP insulin (disiapake ing pH 6); (c) distribusi ukuran partikel nanopartikel insulin sing dioptimalake; (d) mikrograf TEM saka NP insulin sing dioptimalake.
Wis kondhang menawa kitosan iku polielektrolit sing ringkih kanthi pKa 6,5. Iki nduweni muatan positif ing media asam amarga gugus amino utama diprotonasi dening ion hidrogen15. Mulane, asring digunakake minangka pembawa kanggo ngenkapsulasi makromolekul sing nduweni muatan negatif. Ing panliten iki, kitosan digunakake kanggo ngenkapsulasi insulin kanthi titik isoelektrik 5,3. Amarga kitosan digunakake minangka bahan pelapis, kanthi nambah proporsi, kekandelan lapisan njaba nanopartikel mundhak, sing nyebabake ukuran partikel rata-rata sing luwih gedhe. Kajaba iku, tingkat kitosan sing luwih dhuwur bisa ngenkapsulasi luwih akeh insulin. Ing kasus kita, EE paling dhuwur nalika rasio kitosan lan insulin tekan 2,5: 1, lan ora ana owah-owahan sing signifikan ing EE nalika rasio terus mundhak.
Kejaba rasio kitosan lan insulin, pH uga nduweni peran penting ing persiapan NP. Gan et al. 17 nyinaoni efek pH marang ukuran partikel nanopartikel kitosan. Dheweke nemokake penurunan ukuran partikel sing terus-terusan nganti pH tekan 6,0, lan peningkatan ukuran partikel sing signifikan diamati ing pH > 6,0, sing konsisten karo pengamatan kita. Fenomena iki amarga kasunyatan manawa kanthi pH sing saya tambah, molekul insulin entuk muatan permukaan negatif, saengga, luwih disenengi interaksi elektrostatik karo kompleks kitosan/natrium tripolifosfat (TPP), sing nyebabake ukuran partikel cilik lan EE sing dhuwur. Nanging, nalika pH diatur dadi 6,5, gugus amino ing kitosan dideprotonasi, sing nyebabake lipatan kitosan. Mangkono, pH sing dhuwur nyebabake kurang paparan ion amino menyang TPP lan insulin, sing nyebabake cross-linking sing luwih murah, ukuran partikel rata-rata pungkasan sing luwih gedhe lan EE sing luwih murah.
Analisis sipat morfologis NP sing dikeringake beku lan disemprot bisa nuntun pemilihan teknik dehidrasi lan pembentukan bubuk sing luwih apik. Metode sing disenengi kudu nyedhiyakake stabilitas obat, bentuk partikel sing seragam, pemuatan obat sing dhuwur, lan kelarutan sing apik ing larutan asli. Ing panliten iki, kanggo mbandhingake rong teknik kasebut kanthi luwih apik, NP insulin nganggo utawa tanpa manitol 1% digunakake sajrone dehidrasi. Manitol digunakake minangka agen bulking utawa krioprotektan ing macem-macem formulasi bubuk garing kanggo pengeringan beku lan pengeringan semprot. Kanggo nanopartikel insulin liofilisasi tanpa manitol, kaya sing dituduhake ing Gambar 2a, struktur bubuk sing berpori banget kanthi permukaan sing gedhe, ora teratur, lan kasar diamati ing mikroskop elektron pemindaian (SEM). Sawetara partikel diskrit dideteksi ing bubuk sawise dehidrasi (Gambar 2e). Asil kasebut nuduhake yen umume NP diurai sajrone pengeringan beku tanpa krioprotektan. Kanggo nanopartikel insulin sing dikeringake beku lan disemprot sing ngemot 1% manitol, nanopartikel bunder kanthi permukaan sing alus diamati (Gambar 1). 2b,d,f,h). Nanopartikel insulin sing dikeringake nganggo semprotan tanpa manitol tetep bunder nanging keriput ing permukaan (Gambar 2c). Permukaan bunder lan keriput dibahas luwih lanjut ing prilaku pelepasan lan tes serapan seluler ing ngisor iki. Adhedhasar tampilan NP sing garing, NP sing dikeringake nganggo semprotan tanpa manitol lan NP sing dikeringake nganggo beku lan dikeringake nganggo semprotan nganggo manitol ngasilake bubuk NP sing alus (Gambar 2f,g,h). Semakin gedhe area permukaan antarane permukaan partikel, semakin dhuwur kelarutan lan mulane semakin dhuwur tingkat pelepasan.
Morfologi saka macem-macem NP insulin dehidrasi: (a) Gambar SEM saka NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (b) Gambar SEM saka NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (c) NP insulin semprot-garing tanpa manitol Gambar SEM saka ; (d) Gambar SEM saka NP insulin semprot-garing nganggo manitol; (e) gambar bubuk NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (f) gambar NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (g) Gambar bubuk NP insulin semprot-garing tanpa manitol; (h) gambar bubuk NP insulin semprot-garing nganggo manitol.
Sajrone pangatusan beku, manitol tumindak minangka krioprotektan, njaga NP ing bentuk amorf lan nyegah karusakan dening kristal es19. Kosok baline, ora ana langkah pembekuan sajrone pangatusan semprotan. Mulane, manitol ora dibutuhake ing metode iki. Nyatane, NP sing disemprotake tanpa manitol ngasilake NP sing luwih alus kaya sing diterangake sadurunge. Nanging, manitol isih bisa tumindak minangka pengisi ing proses pangatusan semprotan kanggo menehi NP struktur sing luwih bunder20 (Gambar 2d), sing mbantu entuk prilaku pelepasan seragam saka NP sing dienkapsulasi kasebut. Kajaba iku, jelas manawa sawetara partikel gedhe bisa dideteksi ing NP insulin sing disemprotake lan garing sing ngemot manitol (Gambar 2b, d), sing bisa uga amarga akumulasi manitol ing inti partikel bebarengan karo insulin sing dienkapsulasi. Kanggo. Lapisan kitosan. Perlu dicathet yen ing panliten iki, kanggo mesthekake yen struktur bunder tetep utuh sawise dehidrasi, rasio manitol lan kitosan dijaga ing 5:1, supaya jumlah pengisi sing akeh uga bisa nggedhekake ukuran partikel NP sing wis garing.
Spektroskopi refleksi total sing dilemahake inframerah transformasi Fourier (FTIR-ATR) njlentrehake campuran fisik insulin bebas, kitosan, kitosan, TPP lan insulin. Kabeh NP sing didehidrasi dicirikake kanthi nggunakake spektroskopi FTIR-ATR. Khususé, intensitas pita 1641, 1543 lan 1412 cm-1 diamati ing NP sing dienkapsulasi sing dikeringake beku nganggo manitol lan ing NP sing dikeringake semprot nganggo lan tanpa manitol (Gambar 3). Kaya sing dilapurake sadurunge, peningkatan kekuatan iki ana gandhengane karo cross-linking antarane kitosan, TPP lan insulin. Investigasi interaksi antarane kitosan lan insulin nuduhake yen ing spektrum FTIR nanopartikel kitosan sing dimuat insulin, pita kitosan tumpang tindih karo insulin, nambah intensitas karbonil (1641 cm-1) lan sabuk amina (1543 cm-1). Gugus tripolifosfat TPP digandhengake karo gugus amonium ing kitosan, mbentuk pita. ing 1412 cm-1.
Spektrum FTIR-ATR saka insulin bebas, kitosan, campuran fisik kitosan/TPP/insulin lan NP sing didehidrasi nganggo macem-macem metode.
Salajengipun, asil kasebut konsisten karo sing dituduhake ing SEM, sing nuduhake yen NP sing dienkapsulasi tetep utuh nalika disemprot lan dikeringake beku nganggo manitol, nanging tanpa manitol, mung pengeringan semprot sing ngasilake partikel sing dienkapsulasi. Kosok baline, asil spektral FTIR-ATR saka NP sing dikeringake beku tanpa manitol meh padha karo campuran fisik kitosan, TPP, lan insulin. Asil iki nuduhake yen ikatan silang antarane kitosan, TPP lan insulin ora ana maneh ing NP sing dikeringake beku tanpa manitol. Struktur NP dirusak sajrone pengeringan beku tanpa krioprotektan, sing bisa dideleng ing asil SEM (Gambar 2a). Adhedhasar morfologi lan asil FTIR saka NP insulin sing didehidrasi, mung NP liofilisasi, dikeringake semprot, lan bebas manitol sing digunakake kanggo eksperimen rekonstitusi lan NP bebas manitol amarga dekomposisi NP bebas manitol sajrone dehidrasi. rembugan.
Dehidrasi digunakake kanggo panyimpenan jangka panjang lan pangolahan maneh dadi formulasi liyane. Kemampuan NP garing kanggo mbentuk maneh sawise panyimpenan penting banget kanggo panggunaan ing formulasi sing beda-beda kayata tablet lan film. Kita weruh yen ukuran partikel rata-rata NP insulin sing disemprot garing tanpa manitol mung mundhak sithik sawise dibentuk maneh. Ing sisih liya, ukuran partikel nanopartikel insulin sing disemprot garing lan dibekukan garing nganggo manitol mundhak sacara signifikan (Tabel 1). PDI lan EE ora owah sacara signifikan (p > 0,05) sawise rekombinasi kabeh NP ing panliten iki (Tabel 1). Asil iki nuduhake yen sebagian besar partikel tetep utuh sawise dilarutake maneh. Nanging, tambahan manitol nyebabake pemuatan insulin saka nanopartikel manitol sing diliofilisasi lan disemprot garing banget (Tabel 1). Kosok baline, isi beban insulin NP sing disemprot garing tanpa manitol tetep padha karo sadurunge (Tabel 1).
Wis dingerteni manawa pemuatan nanopartikel iku penting banget nalika digunakake kanggo tujuan pangiriman obat. Kanggo NP kanthi pemuatan sing sithik, jumlah materi sing akeh banget dibutuhake kanggo tekan ambang terapeutik. Nanging, viskositas sing dhuwur saka konsentrasi NP sing dhuwur kasebut nyebabake rasa ora nyaman lan kangelan ing administrasi oral lan formulasi injeksi, masing-masing 22. Kajaba iku, NP insulin uga bisa digunakake kanggo nggawe tablet lan biofilm kental 23, 24, sing mbutuhake panggunaan NP kanthi jumlah akeh ing tingkat pemuatan sing sithik, sing nyebabake tablet gedhe lan biofilm kandel sing ora cocog kanggo aplikasi oral. Mulane, NP dehidrasi kanthi beban insulin sing dhuwur banget dikarepake. Asil kita nuduhake manawa beban insulin sing dhuwur saka NP semprotan garing bebas manitol bisa menehi akeh kaluwihan sing menarik kanggo metode pangiriman alternatif iki.
Kabeh NP sing wis didehidrasi disimpen ing kulkas sajrone telung sasi. Asil SEM nuduhake yen morfologi kabeh NP sing wis didehidrasi ora owah sacara signifikan sajrone panyimpenan telung sasi (Gambar 4). Sawise direkonstitusi ing banyu, kabeh NP nuduhake penurunan EE sing sithik lan ngeculake kira-kira jumlah cilik (~5%) insulin sajrone periode panyimpenan telung sasi (Tabel 2). Nanging, ukuran partikel rata-rata kabeh nanopartikel tambah. Ukuran partikel NP sing disemprotake tanpa manitol tambah dadi 525 nm, dene NP sing disemprotake lan dibekukan nganggo manitol tambah dadi 872 lan 921 nm (Tabel 2).
Morfologi saka macem-macem NP insulin dehidrasi sing disimpen sajrone telung sasi: (a) Gambar SEM saka NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (b) Gambar SEM saka nanopartikel insulin sing disemprot tanpa manitol; (c) tanpa manitol Gambar SEM saka NP insulin sing disemprot.
Salajengipun, endapan katon ing nanopartikel insulin sing direkonstitusi sing disemprotake nganggo manitol lan dikeringake beku (Gambar S2). Iki bisa uga disebabake dening partikel gedhe sing ora nyusup kanthi bener ing banyu. Kabeh asil ing ndhuwur nuduhake yen teknik pengeringan semprot bisa nglindhungi nanopartikel insulin saka dehidrasi lan muatan nanopartikel insulin sing dhuwur bisa dipikolehi tanpa pengisi utawa krioprotektan.
Retensi insulin diuji ing medium pH = 2,5 nganggo pepsin, tripsin, lan α-chymotrypsin kanggo nduduhake kemampuan protèktif NP nglawan pencernaan enzimatik sawise dehidrasi. Retensi insulin NP sing dehidrasi dibandhingake karo NP sing nembe disiapake, lan insulin bebas digunakake minangka kontrol negatif. Ing panliten iki, insulin bebas nuduhake eliminasi insulin kanthi cepet sajrone 4 jam ing kabeh telung perawatan enzimatik (Gambar 5a-c). Kosok baline, uji eliminasi insulin NP sing dibekukan nganggo manitol lan NP sing disemprot nganggo utawa tanpa manitol nuduhake perlindungan NP kasebut sing luwih dhuwur tinimbang pencernaan enzimatik, sing padha karo NP insulin sing nembe disiapake (gambar 1).5a-c). Kanthi bantuan nanopartikel ing pepsin, tripsin, lan α-chymotrypsin, luwih saka 50%, 60%, lan 75% insulin bisa dilindhungi sajrone 4 jam, masing-masing (Gambar 5a-c). Kemampuan protèktif insulin iki bisa uga nambah kemungkinan panyerepan insulin sing luwih dhuwur menyang aliran getih25. Asil kasebut nuduhake yen pengeringan semprot nganggo utawa tanpa manitol lan pengeringan beku nganggo manitol bisa njaga kemampuan NP-protektif insulin sawise dehidrasi.
Prilaku pangayoman lan pelepasan NP insulin dehidrasi: (a) pangayoman insulin ing larutan pepsin; (b) pangayoman insulin ing larutan tripsin; (c) pangayoman insulin dening larutan α-kimotripsin; (d) Prilaku pelepasan NP dehidrasi ing larutan pH = 2,5; (e) prilaku pelepasan NP dehidrasi ing larutan pH = 6,6; (f) prilaku pelepasan NP dehidrasi ing larutan pH = 7,0.
NP insulin garing sing nembe disiapake lan direkonstitusi diinkubasi ing macem-macem buffer (pH = 2,5, 6,6, 7,0) ing suhu 37 °C, kanthi simulasi lingkungan pH lambung, duodenum, lan usus alus sisih ndhuwur, kanggo mriksa efek insulin marang resistensi insulin. Prilaku pelepasan ing lingkungan sing beda-beda. Fragmen saluran pencernaan. Ing pH = 2,5, NP sing diisi insulin lan NP insulin garing sing dilarutake maneh nuduhake pelepasan burst awal sajrone sak jam pisanan, banjur pelepasan alon sajrone 5 jam sabanjure (Gambar 5d). Pelepasan cepet iki ing wiwitan kemungkinan gedhe minangka asil saka desorpsi permukaan molekul protein sing cepet sing ora diimobilisasi kanthi lengkap ing struktur internal partikel. Ing pH = 6,5, NP sing diisi insulin lan NP insulin garing sing dibentuk maneh nuduhake pelepasan sing alus lan alon sajrone 6 jam, amarga pH larutan tes padha karo larutan sing disiapake NP (Gambar 5e). Ing pH = 7, NP ora stabil lan meh bosok kabeh sajrone rong jam pisanan (Gambar 5f). Iki amarga deprotonasi kitosan kedadeyan ing pH sing luwih dhuwur, sing nyebabake jaringan polimer sing kurang kompak lan pelepasan insulin sing diisi.
Salajengipun, NP insulin sing dikeringake nganggo semprotan tanpa manitol nuduhake profil pelepasan sing luwih cepet tinimbang NP dehidrasi liyane (Gambar 5d–f). Kaya sing wis diterangake sadurunge, NP insulin sing direkonstitusi sing dikeringake tanpa manitol nuduhake ukuran partikel paling cilik. Partikel cilik nyedhiyakake area permukaan sing luwih gedhe, saengga umume obat sing relevan bakal ana ing utawa cedhak permukaan partikel, sing nyebabake pelepasan obat kanthi cepet26.
Sitotoksisitas NP diselidiki nganggo uji MTT. Kaya sing dituduhake ing Gambar S4, kabeh NP sing dehidrasi ditemokake ora duwe pengaruh sing signifikan marang kelangsungan urip sel ing konsentrasi 50-500 μg/ml, sing nuduhake yen kabeh NP sing dehidrasi bisa digunakake kanthi aman kanggo nggayuh jendela terapeutik.
Ati iku organ utama sing digunakake insulin kanggo nindakake fungsi fisiologis. Sel HepG2 minangka garis sel hepatoma manungsa sing umum digunakake minangka model serapan hepatosit in vitro. Ing kene, sel HepG2 digunakake kanggo netepake serapan seluler NP sing didehidrasi nggunakake metode pengeringan beku lan pengeringan semprot. Serapan seluler kanthi pemindaian laser confocal nggunakake sitometri aliran lan visi sawise sawetara jam inkubasi karo insulin FITC gratis kanthi konsentrasi 25 μg / mL, NP sing diisi insulin FITC sing nembe disiapake lan NP sing diisi insulin FITC sing didehidrasi kanthi konsentrasi insulin sing padha. Pengamatan mikroskopi kuantitatif (CLSM) ditindakake. NP sing diliofilisasi tanpa manitol dirusak sajrone dehidrasi lan ora dievaluasi ing tes iki. Intensitas fluoresensi intraseluler NP sing diisi insulin sing nembe disiapake, NP sing diliofilisasi nganggo manitol, lan NP sing disemprotake nganggo lan tanpa manitol (Gambar 6a) yaiku 4,3, 2,6, 2,4, lan 4,1 kali luwih dhuwur tinimbang sing bebas. Klompok FITC-insulin, mungguh-mungguh (Gambar 6b). Asil kasebut nuduhake yen insulin sing dienkapsulasi luwih kuat ing serapan seluler tinimbang insulin bebas, utamane amarga ukuran nanopartikel sing dimuat insulin sing luwih cilik sing diasilake ing panliten kasebut.
Serapan sel HepG2 sawise inkubasi 4 jam karo NP sing nembe disiapake lan NP sing wis didehidrasi: (a) Distribusi serapan insulin FITC dening sel HepG2. (b) Rata-rata geometris saka intensitas fluoresensi sing dianalisis kanthi flow cytometry (n = 3), *P < 0,05 dibandhingake karo insulin bebas.
Semono uga, gambar CLSM nuduhake yen intensitas fluoresensi FITC saka NP sing diisi insulin FITC sing nembe disiapake lan NP sing disemprot-garing sing diisi insulin FITC (tanpa manitol) luwih kuwat tinimbang sampel liyane (Gambar 6a). Salajengipun, kanthi tambahan manitol, viskositas larutan sing luwih dhuwur nambah resistensi kanggo serapan seluler, sing nyebabake penurunan proliferasi insulin. Asil kasebut nuduhake yen NP sing disemprot-garing bebas manitol nuduhake efisiensi serapan seluler paling dhuwur amarga ukuran partikel luwih cilik tinimbang NP sing dibekukan sawise dilarutake maneh.
Kitosan (bobot molekul rata-rata 100 KDa, 75–85% deasetilasi) dituku saka Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Natrium tripolifosfat (TPP) dituku saka VWR (Radnor, Pennsylvania, AS). Insulin manungsa rekombinan sing digunakake ing panliten iki saka Fisher Scientific (Waltham, MA, AS). Insulin manungsa sing diwenehi label Fluorescein isothiocyanate (FITC) lan 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) dituku saka Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Garis sel HepG2 dipikolehi saka ATCC (Manassas, Virginia, AS). Kabeh reagen liyane duwe kelas analitis utawa kromatografi.
Siapke larutan CS 1 mg/ml kanthi nglarutake ing banyu suling ganda (banyu DD) sing ngandhut asam asetat 0,1%. Siapke larutan TPP lan insulin 1 mg/ml kanthi nglarutake ing banyu DD lan asam asetat 0,1%. Pra-emulsi disiapake nganggo homogenizer kecepatan tinggi polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Proses persiapan kaya ing ngisor iki: pisanan, 2 ml larutan TPP ditambahake menyang 4 ml larutan insulin, lan campuran kasebut diaduk sajrone 30 menit lan dicampur kanthi lengkap. Banjur, larutan campuran ditambahake tetes demi tetes menyang larutan CS liwat jarum suntik kanthi diaduk kanthi kecepatan tinggi (10.000 rpm). Campuran kasebut dijaga kanthi diaduk kanthi kecepatan tinggi (15.000 rpm) ing bak es sajrone 30 menit, lan diatur menyang pH tartamtu kanggo entuk NP insulin sing disambung silang. Kanggo luwih homogenisasi lan nyuda ukuran partikel NP insulin, disonikasi sajrone 30 menit tambahan ing bak es nggunakake sonikator tipe probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Jerman).
NPS insulin diuji kanggo diameter rata-rata Z, indeks polidispersitas (PDI) lan potensial zeta nggunakake pangukuran hamburan cahya dinamis (DLS) nggunakake Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) kanthi ngencerake ing banyu DD ing suhu 25°C. Morfologi lan distribusi ukuran dikarakterisasi nganggo mikroskop elektron transmisi Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Tokyo, Jepang), lan gambar banjur dianalisis nggunakake piranti lunak pencitraan Hitachi (Hitachi, Tokyo, Jepang). Kanggo netepake efisiensi enkapsulasi (EE) lan kapasitas pemuatan (LC) NP insulin, NP dipipet menyang tabung ultrafiltrasi kanthi cut-off bobot molekul 100 kDa lan disentrifugasi ing 500 xg sajrone 30 menit. Insulin sing ora dienkapsulasi ing filtrat diukur nggunakake sistem HPLC Seri Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, California, USA) sing kasusun saka pompa kuaterner, autosampler, kolom pemanas, lan detektor DAD. Insulin dianalisis nganggo kolom C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) lan dideteksi ing 214 nm. Fase gerak yaiku asetonitril lan banyu, sing ngandhut 0,1% TFA, rasio gradien saka 10/90 nganti 100/0, lan dilakokake sajrone 10 menit. Fase gerak dipompa kanthi laju aliran 1,0 ml/menit. Suhu kolom disetel dadi 20 °C. Hitung persentase EE lan LC nggunakake persamaan. (1) lan Persamaan. (2).
Maneka warna rasio CS/insulin wiwit saka 2,0 nganti 4,0 dites kanggo ngoptimalake NP insulin. Jumlah larutan CS sing beda-beda ditambahake sajrone persiapan, dene campuran insulin/TPP dijaga tetep. NP Insulin disiapake ing kisaran pH 4,0 nganti 6,5 kanthi ngontrol pH campuran kanthi ati-ati sawise nambahake kabeh larutan (insulin, TPP lan CS). EE lan ukuran partikel nanopartikel insulin dievaluasi ing nilai pH sing beda-beda lan rasio massa CS/insulin kanggo ngoptimalake pembentukan NP insulin.
NP insulin sing dioptimalake dilebokake ing wadhah aluminium lan ditutup nganggo tisu sing diketat nganggo selotip. Sabanjure, wadhah sing wis disekrup dilebokake ing pengering beku Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) sing dilengkapi pengering tray. Suhu lan tekanan vakum disetel ing -10 °C, 0,350 Torr sajrone 2 jam pisanan, lan 0 °C lan 0,120 Torr sajrone 22 jam sisa saka 24 jam kanggo entuk NP insulin garing.
Pengering Semprot Mini Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Swiss) digunakake kanggo ngasilake insulin sing dienkapsulasi. Parameter pangatusan sing dipilih yaiku: suhu 100 °C, aliran umpan 3 L/menit, lan aliran gas 4 L/menit.
NP insulin sadurunge lan sawise dehidrasi dikarakterisasi nggunakake spektroskopi FTIR-ATR. Nanopartikel sing didehidrasi uga insulin bebas lan kitosan dianalisis nggunakake spektrofotometer Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) sing dilengkapi aksesoris sampling ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Rata-rata sinyal dipikolehi saka 16 pindai kanthi resolusi 4 cm2 ing rentang frekuensi 4000-600 cm2.
Morfologi NP insulin garing ditaksir nganggo gambar SEM saka NP insulin garing beku lan garing semprot sing dijupuk nganggo Mikroskop Elektron Pemindai Sinar Ion Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Parameter utama sing digunakake yaiku voltase 5 keV lan arus 30 mA.
Kabeh NP insulin sing wis didehidrasi dilarutake maneh ing banyu dd. Ukuran partikel, PDI, EE lan LC diuji maneh nggunakake cara sing padha sing kasebut sadurunge kanggo netepake kualitas sawise dehidrasi. Stabilitas NP anhidroinsulin uga diukur kanthi nguji sifat NP sawise panyimpenan sing suwe. Ing panliten iki, kabeh NP sawise dehidrasi disimpen ing kulkas sajrone telung wulan. Sawise telung wulan panyimpenan, NP diuji kanggo ukuran partikel morfologis, PDI, EE lan LC.
Larutake 5 mL NP sing wis direkonstitusi ing 45 mL sing ngemot cairan lambung simulasi (pH 1.2, ngemot 1% pepsin), cairan usus (pH 6.8, ngemot 1% tripsin) utawa larutan kimotripsin (100 g/mL, ing buffer fosfat, pH 7.8) kanggo ngevaluasi efektifitas insulin kanggo nglindhungi NP sawise dehidrasi. Insulin kasebut diinkubasi ing suhu 37°C kanthi kecepatan agitasi 100 rpm. 500 μL larutan dikumpulake ing titik wektu sing beda-beda lan konsentrasi insulin ditemtokake dening HPLC.
Prilaku pelepasan in vitro saka NP insulin sing nembe disiapake lan didehidrasi diuji nganggo metode kantong dialisis (potongan bobot molekul 100 kDa, Spectra Por Inc.). NP garing sing nembe disiapake lan direkonstitusi didialisis ing cairan ing pH 2,5, pH 6,6, lan pH 7,0 (0,1 M phosphate-buffered saline, PBS) kanggo simulasi lingkungan pH weteng, duodenum, lan usus alus ndhuwur. Kabeh sampel diinkubasi ing suhu 37 °C kanthi terus digoyang ing 200 rpm. Aspirasi cairan ing njaba kantong dialisis 5 mL ing wektu ing ngisor iki: 0,5, 1, 2, 3, 4, lan 6 jam, lan langsung isi volume nganggo dialisat seger. Kontaminasi insulin ing cairan dianalisis nganggo HPLC, lan tingkat pelepasan insulin saka nanopartikel diitung saka rasio insulin bebas sing dirilis karo total insulin sing dienkapsulasi ing nanopartikel (Persamaan 3).
Sel HepG2 garis sel karsinoma hepatoseluler manungsa ditumbuhake ing piring diameter 60 mm nggunakake Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) sing ngemot 10% serum janin sapi, 100 IU/mL penisilin, lan 100 μg/mL streptomisin29. Kultur dijaga ing suhu 37°C, kelembapan relatif 95%, lan 5% CO2. Kanggo uji serapan, sel HepG2 diumbi ing 1 × 105 sel/ml menyang sistem slide ruang Nunc Lab-Tek 8-sumur (Thermo Fisher, NY, USA). Kanggo uji sitotoksisitas, diumbi ing piring 96-sumur (Corning, NY, USA) kanthi kapadhetan 5 × 104 sel/ml.
Uji MTT digunakake kanggo ngevaluasi sitotoksisitas insulin NPs30 sing nembe disiapake lan didehidrasi. Sel HepG2 disebar ing piring 96-sumur kanthi kapadhetan 5 × 104 sel/mL lan dikultur sajrone 7 dina sadurunge diuji. NP Insulin diencerake menyang macem-macem konsentrasi (50 nganti 500 μg/mL) ing medium kultur banjur diwenehake menyang sel. Sawise 24 jam inkubasi, sel dicuci kaping 3 nganggo PBS lan diinkubasi karo medium sing ngemot 0,5 mg/ml MTT sajrone 4 jam tambahan. Sitotoksisitas ditaksir kanthi ngukur reduksi enzimatik tetrazolium MTT kuning dadi formazan ungu ing 570 nm nggunakake pembaca piring spektrofotometer pro Tecan infinite M200 (Tecan, Männedorf, Swiss).
Efisiensi serapan seluler NP diuji nganggo mikroskop pemindaian laser confocal lan analisis flow cytometry. Saben sumur sistem slide ruang Nunc Lab-Tek diolah nganggo FITC-insulin bebas, FITC-insulin-loaded NPs, lan dibentuk maneh 25 μg/mL FITC-insulin NPs sing didehidrasi kanthi konsentrasi sing padha lan diinkubasi sajrone 4 jam. Sel dicuci kaping 3 nganggo PBS lan difiksasi nganggo 4% paraformaldehida. Inti diwarnai nganggo 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lokalisasi insulin diamati nggunakake mikroskop pemindaian laser/rong-foton Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Jepang). Kanggo analisis flow cytometry, konsentrasi sing padha saka 10 μg/mL FITC-insulin bebas, FITC-insulin-loaded NPs, lan FITC-insulin NPs sing didehidrasi sing dilarutake ditambahake ing piring 96-sumur sing diungguli sel HepG2 lan diinkubasi sajrone 4 jam. Sawisé inkubasi 4 jam, sèl dicopot lan dikumbah kaping 3 nganggo FBS. 5 × 104 sèl saben sampel dianalisis nganggo BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Amerika Serikat).
Kabeh nilai kasebut ditulis minangka rata-rata ± deviasi standar. Perbandingan antarane kabeh klompok ditaksir nggunakake ANOVA siji arah utawa uji-t dening IBM SPSS Statistics 26 kanggo Mac (IBM, Endicott, New York, USA) lan p <0,05 dianggep signifikan sacara statistik.
Panliten iki nduduhake keluwesan lan kemampuan pengeringan semprot kanggo ngeringake nanopartikel kitosan/TPP/insulin sing disambung silang kanthi rekonstitusi sing luwih apik dibandhingake karo metode pengeringan beku standar sing nggunakake agen bulking utawa kapasitas krioprotektan lan kapasitas beban sing luwih dhuwur. Nanopartikel insulin sing dioptimalake ngasilake ukuran partikel rata-rata 318 nm lan efisiensi enkapsulasi 99,4%. Asil SEM lan FTIR sawise dehidrasi nuduhake yen struktur sferis mung dijaga ing NP sing disemprotake nganggo lan tanpa manitol lan diliofilisasi nganggo manitol, nanging NP sing diliofilisasi tanpa manitol diurai sajrone dehidrasi. Ing tes kemampuan rekonstitusi, nanopartikel insulin sing disemprotake tanpa manitol nuduhake ukuran partikel rata-rata paling cilik lan beban paling dhuwur nalika rekonstitusi. Prilaku pelepasan kabeh NP sing didehidrasi iki nuduhake yen dheweke cepet dirilis ing larutan pH = 2,5 lan pH = 7, lan stabil banget ing larutan pH = 6,5. Dibandhingake karo NP dehidrasi liyane sing dilarutake maneh, NP kasebut Disemprotake tanpa manitol nuduhake pelepasan paling cepet. Asil iki konsisten karo sing diamati ing uji serapan seluler, amarga NP sing disemprotake tanpa manitol meh kabeh njaga efisiensi serapan seluler NP sing nembe disiapake. Asil kasebut nuduhake yen nanopartikel insulin garing sing disiapake kanthi pengeringan semprot bebas manitol paling cocog kanggo diproses luwih lanjut dadi bentuk dosis anhidrat liyane, kayata tablet oral utawa film bioadhesif.
Amarga masalah properti intelektual, set data sing digawe lan/utawa dianalisis sajrone panliten saiki ora kasedhiya kanggo umum, nanging kasedhiya saka penulis sing gegandhengan yen ana panyuwunan sing cukup.
Kagan, A. Diabetes tipe 2: asal-usul sosial lan ilmiah, komplikasi medis, lan implikasi kanggo pasien lan wong liya. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Pangembangan enkapsulasi insulin: apa administrasi oral saiki bisa ditindakake? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Kemajuan anyar ing sistem pangiriman liposom oral sing dimuat insulin kanggo perawatan diabetes. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).