Artikel iki minangka bagéan saka topik riset "Ningkatake resistensi kacang-kacangan marang patogen lan hama", deleng kabeh 5 artikel
Agen penyebab nekrosis penyakit tanduran jamur Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary nggunakake strategi multi-tingkat kanggo nginfeksi tanduran inang sing beda. Panliten iki ngusulake panggunaan diamine L-ornitin, asam amino non-protein sing ngrangsang sintesis asam amino esensial liyane, minangka strategi manajemen alternatif kanggo ningkatake respon molekuler, fisiologis, lan biokimia Phaseolus vulgaris L. marang jamur putih sing disebabake dening Pseudomonas sclerotiorum. Eksperimen in vitro nuduhake yen L-ornitin sacara signifikan nyegah pertumbuhan miselium S. pyrenoidosa kanthi cara sing gumantung karo dosis. Kajaba iku, bisa nyuda keruwetan jamur putih kanthi signifikan ing kahanan omah kaca. Salajengipun, L-ornitin ngrangsang pertumbuhan tanduran sing diobati, nuduhake yen konsentrasi L-ornitin sing diuji ora fitotoksik kanggo tanduran sing diobati. Kajaba iku, L-ornitin nambah ekspresi antioksidan non-enzimatik (total fenolik lan flavonoid sing larut) lan antioksidan enzimatik (katalase (CAT), peroksidase (POX), lan polifenol oksidase (PPO)), lan nambah ekspresi telung gen sing ana gandhengane karo antioksidan (PvCAT1, PvSOD, lan PvGR). Salajengipun, analisis in silico nuduhake anané protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) putatif ing genom S. sclerotiorum, sing meh padha karo protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) saka Aspergillus fijiensis (AfOAH) lan Penicillium sp. (PlOAH) babagan analisis fungsional, domain sing dilestarikake, lan topologi. Menariknya, tambahan L-ornitin menyang medium kaldu dekstrosa kentang (PDB) sacara signifikan nyuda ekspresi gen SsOAH ing miselia S. sclerotiorum. Semono uga, aplikasi eksogen L-ornitin nyuda ekspresi gen SsOAH kanthi signifikan ing miselia jamur sing diklumpukake saka tanduran sing diobati. Pungkasan, aplikasi L-ornitin nyuda sekresi asam oksalat kanthi signifikan ing medium PDB lan godhong sing kena infeksi. Kesimpulane, L-ornitin nduweni peran penting kanggo njaga status redoks uga ningkatake respon pertahanan tanduran sing kena infeksi. Asil panliten iki bisa mbantu ngembangake metode inovatif lan ramah lingkungan kanggo ngontrol jamur putih lan nyuda dampak ing produksi kacang buncis lan tanduran liyane.
Jamur putih, sing disebabake dening jamur nekrotropik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, minangka penyakit sing ngrusak lan nyuda panen sing dadi ancaman serius kanggo produksi kacang buncis global (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum minangka salah sawijining patogen tanduran jamur sing ditularake ing lemah sing paling angel dikendhaleni, kanthi macem-macem inang luwih saka 600 spesies tanduran lan kemampuan kanggo ngrusak jaringan inang kanthi cepet kanthi cara sing ora spesifik (Liang lan Rollins, 2018). Ing kahanan sing ora becik, jamur iki ngalami fase kritis ing siklus uripe, tetep ora aktif sajrone wektu sing suwe minangka struktur ireng, atos, kaya wiji sing diarani 'sclerotia' ing lemah utawa minangka pertumbuhan putih sing alus ing miselium utawa empulur batang tanduran sing kena infeksi (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum bisa mbentuk sclerotia, sing ngidini bisa urip ing lapangan sing kena infeksi sajrone wektu sing suwe lan tahan sajrone penyakit (Schwartz et al., 2005). Sclerotia sugih nutrisi, bisa tahan ing lemah sajrone wektu sing suwe, lan dadi inokulum utama kanggo infeksi sabanjure (Schwartz et al., 2005). Ing kahanan sing apik, sclerotia bakal thukul lan ngasilake spora sing ana ing udhara sing bisa nginfeksi kabeh bagean tanduran ing ndhuwur lemah, kalebu nanging ora winates ing kembang, batang, utawa polong (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum migunakaké strategi multi-tingkat kanggo nginfeksi tanduran inangé, sing nglibataké serangkaian kedadeyan sing terkoordinasi wiwit saka perkecambahan sklerotial nganti perkembangan gejala. Kapisan, S. sclerotiorum ngasilaké spora sing digantung (disebut askospora) saka struktur kaya jamur sing diarani apothecia, sing dadi udhara lan berkembang dadi sklerotia non-motil ing sisa-sisa tanduran sing kena infeksi (Bolton et al., 2006). Jamur banjur ngetokake asam oksalat, faktor virulensi, kanggo ngontrol pH dinding sel tanduran, ningkatake degradasi enzimatik lan invasi jaringan (Hegedus lan Rimmer, 2005), lan nyegah ledakan oksidatif tanduran inang. Proses pengasaman iki nglemahake dinding sel tanduran, nyedhiyakake lingkungan sing apik kanggo operasi normal lan efisien enzim perusak dinding sel jamur (CWDE), sing ngidini patogen ngatasi alangan fisik lan nembus jaringan inang (Marciano et al., 1983). Sawise ditembus, S. sclerotiorum ngetokake sawetara CWDE, kayata polygalacturonase lan selulase, sing nggampangake panyebaran ing jaringan sing kena infeksi lan nyebabake nekrosis jaringan. Perkembangan lesi lan tikar hifa nyebabake gejala khas jamur putih (Hegedus lan Rimmer, 2005). Sauntara kuwi, tanduran inang ngenali pola molekuler sing ana gandhengane karo patogen (PAMP) liwat reseptor pangenalan pola (PRR), sing micu serangkaian acara sinyal sing pungkasane ngaktifake respon pertahanan.
Senajan wis pirang-pirang dekade upaya pengendalian penyakit, kekurangan plasma nutfah tahan sing cukup isih ana ing kacang buncis, kaya ing tanduran komersial liyane, amarga resistensi, kaslametan, lan kemampuan adaptasi patogen. Mula, manajemen penyakit dadi tantangan banget lan mbutuhake strategi terpadu lan multifaset sing kalebu kombinasi praktik budaya, kontrol biologis, lan fungisida kimia (O'Sullivan et al., 2021). Pengendalian kimia jamur putih paling efektif amarga fungisida, nalika ditrapake kanthi bener lan ing wektu sing tepat, bisa ngontrol panyebaran penyakit kanthi efektif, nyuda keruwetan infeksi, lan nyuda kerugian panen. Nanging, panggunaan sing berlebihan lan katergantungan sing berlebihan marang fungisida bisa nyebabake munculé galur S. sclerotiorum sing tahan lan menehi dampak negatif marang organisme non-target, kesehatan lemah, lan kualitas banyu (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Mulane, nemokake alternatif sing ramah lingkungan wis dadi prioritas utama.
Poliamina (PA), kayata putrescine, spermidine, spermine, lan cadaverine, bisa dadi alternatif sing njanjeni nglawan patogen tanduran sing ana ing lemah, saengga bisa nyuda panggunaan fungisida kimia mbebayani kanthi lengkap utawa sebagian (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Ing tanduran sing luwih dhuwur, PA melu ing akeh proses fisiologis kalebu, nanging ora winates ing, pembelahan sel, diferensiasi, lan respon marang stres abiotik lan biotik (Killiny lan Nehela, 2020). Dheweke bisa tumindak minangka antioksidan, mbantu nggoleki spesies oksigen reaktif (ROS), njaga homeostasis redoks (Nehela lan Killiny, 2023), ngindhuksi gen sing ana gandhengane karo pertahanan (Romero et al., 2018), ngatur macem-macem jalur metabolisme (Nehela lan Killiny, 2023), modulasi fitohormon endogen (Nehela lan Killiny, 2019), netepake resistensi sing dipikolehi sistemik (SAR), lan ngatur interaksi tanduran-patogen (Nehela lan Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Perlu dicathet yen mekanisme lan peran khusus PA ing pertahanan tanduran beda-beda gumantung saka spesies tanduran, patogen, lan kahanan lingkungan. PA sing paling akeh ing tanduran dibiosintesis saka poliamina L-ornitin penting (Killiny lan Nehela, 2020).
L-ornitin nduweni pirang-pirang peran ing pertumbuhan lan perkembangan tanduran. Contone, panliten sadurunge nuduhake yen ing pari (Oryza sativa), ornitin bisa uga ana gandhengane karo daur ulang nitrogen (Liu et al., 2018), asil pari, kualitas lan aroma (Lu et al., 2020), lan respon stres banyu (Yang et al., 2000). Salajengipun, aplikasi eksogen L-ornitin nambah toleransi kekeringan ing bit gula (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) lan nyuda stres uyah ing tanduran bawang (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu lan Çavuşoǧlu, 2021) lan mete (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Peran potensial L-ornitin ing pertahanan stres abiotik bisa uga amarga keterlibatane ing akumulasi prolin ing tanduran sing diobati. Contone, gen sing ana gandhengane karo metabolisme prolin, kayata gen ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) lan prolin dehidrogenase (ProDH1 lan ProDH2), sadurunge wis dilapurake melu pertahanan Nicotiana benthamiana lan Arabidopsis thaliana nglawan galur Pseudomonas syringae non-inang (Senthil-Kumar lan Mysore, 2012). Ing sisih liya, fungal ornithine decarboxylase (ODC) dibutuhake kanggo pertumbuhan patogen (Singh et al., 2020). Targeting ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici liwat pembungkaman gen sing diinduksi inang (HIGS) sacara signifikan nambah resistensi tanduran tomat marang layu Fusarium (Singh et al., 2020). Nanging, peran potensial aplikasi ornithine eksogen nglawan stres biotik kayata fitopatogen durung ditliti kanthi apik. Sing luwih penting, efek ornitin marang resistensi penyakit lan fenomena biokimia lan fisiologis sing ana gandhengane isih durung diteliti.
Ngerteni kerumitan infeksi S. sclerotiorum ing kacang-kacangan iku penting kanggo pangembangan strategi kontrol sing efektif. Ing panliten iki, tujuane yaiku kanggo ngenali peran potensial diamine L-ornitin minangka faktor kunci kanggo ningkatake mekanisme pertahanan lan resistensi tanduran kacang-kacangan marang infeksi Sclerotinia sclerotiorum. Kita duwe hipotesis manawa, saliyane ningkatake respon pertahanan tanduran sing kena infeksi, L-ornitin uga nduweni peran kunci kanggo njaga status redoks. Kita ngusulake manawa efek potensial L-ornitin ana hubungane karo regulasi mekanisme pertahanan antioksidan enzimatik lan non-enzimatik lan gangguan karo faktor patogenisitas/virulensi jamur lan protein sing ana gandhengane. Fungsi ganda L-ornitin iki ndadekake calon sing janjeni kanggo strategi sing lestari kanggo nyuda dampak jamur putih lan nambah resistensi tanduran kacang-kacangan umum marang patogen jamur sing kuat iki. Asil panliten saiki bisa mbantu pangembangan metode inovatif lan ramah lingkungan kanggo ngontrol jamur putih lan nyuda dampake marang produksi kacang-kacangan.
Ing panliten iki, varietas komersial kacang buncis sing rentan, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), digunakake minangka bahan eksperimen. Wiji sing sehat diwenehake kanthi becik dening Departemen Riset Kacang-kacangan, Institut Riset Tanaman Lapangan (FCRI), Pusat Riset Pertanian (ARC), Mesir. Lima wiji disebar ing pot plastik (diameter njero 35 cm, jerone 50 cm) sing diisi lemah sing kena infeksi S. sclerotiorum ing kahanan omah kaca (25 ± 2 °C, kelembapan relatif 75 ± 1%, 8 jam padhang/16 jam peteng). Ing 7-10 dina sawise nyebar (DPS), tunas ditipisake supaya mung kari rong tunas kanthi pertumbuhan seragam lan telung godhong sing ngembang kanthi lengkap ing saben pot. Kabeh tanduran pot disiram saben rong minggu lan diwenehi pupuk saben wulan kanthi tingkat sing disaranake kanggo varietas sing diwenehake.
Kanggo nyiyapake konsentrasi 500 mg/L L-ornitinediamine (uga dikenal minangka asam (+)-(S)-2,5-diaminopentanoat; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), 50 mg dilarutake dhisik ing 100 mL banyu suling steril. Larutan stok banjur diencerake lan digunakake ing eksperimen sabanjure. Secara ringkes, enem seri konsentrasi L-ornitine (12,5, 25, 50, 75, 100, lan 125 mg/L) diuji in vitro. Kajaba iku, banyu suling steril digunakake minangka kontrol negatif (Mock) lan fungisida komersial "Rizolex-T" bubuk sing bisa dibasahke 50% (toclofos-metil 20% + thiram 30%; Perusahaan Pestisida lan Bahan Kimia KZ-Kafr El Zayat, Kafr El Zayat, Gubernur Gharbia, Mesir) digunakake minangka kontrol positif. Fungisida komersial "Rizolex-T" diuji in vitro ing limang konsentrasi (2, 4, 6, 8 lan 10 mg/L).
Sampel batang lan polong kacang buncis umum sing nuduhake gejala khas jamur putih (tingkat infestasi: 10-30%) dikumpulake saka pertanian komersial. Sanajan umume bahan tanduran sing kena infeksi diidentifikasi miturut spesies/varietas (varietas komersial sing rentan Giza 3), liyane, utamane sing dipikolehi saka pasar lokal, kalebu spesies sing ora dingerteni. Bahan sing kena infeksi sing dikumpulake dhisik didisinfeksi permukaan nganggo larutan natrium hipoklorit 0,5% sajrone 3 menit, banjur dibilas kaping pirang-pirang nganggo banyu suling steril lan diusap nganti garing nganggo kertas saring steril kanggo mbusak banyu sing berlebihan. Organ sing kena infeksi banjur dipotong dadi potongan cilik saka jaringan tengah (antarane jaringan sehat lan sing kena infeksi), dibudidayakake ing medium agar dekstrosa kentang (PDA) lan diinkubasi ing suhu 25 ± 2 °C kanthi siklus cahya 12 jam/peteng 12 jam sajrone 5 dina kanggo ngrangsang pembentukan sklerotia. Metode ujung miselium uga digunakake kanggo nyuceni isolat jamur saka kultur campuran utawa sing terkontaminasi. Isolat jamur sing dimurnike dhisik diidentifikasi adhedhasar karakteristik morfologis kultur lan banjur dikonfirmasi dadi S. sclerotiorum adhedhasar fitur mikroskopis. Pungkasan, kabeh isolat sing dimurnèkaké diuji patogenisitas ing kultivar kacang umum Giza 3 sing rentan kanggo nyukupi postulat Koch.
Kajaba iku, isolat S. sclerotiorum sing paling invasif (isolat #3) luwih dikonfirmasi adhedhasar sekuensing spacer transkripsi internal (ITS) kaya sing diterangake dening White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Secara ringkes, isolat dibudidayakake ing duduh kaldu dekstrosa kentang (PDB) lan diinkubasi ing suhu 25 ± 2 °C sajrone 5-7 dina. Miselium jamur banjur dikumpulake, disaring nganggo kain kasa, dikumbah kaping pindho nganggo banyu steril, lan dikeringake nganggo kertas saring steril. DNA genomik diisolasi nggunakake Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Wilayah rDNA ITS banjur diamplifikasi nggunakake pasangan primer spesifik ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ukuran sing diarepake: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Produk PCR sing wis dimurnèkaké dikirim kanggo sekuensing (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Urutan rDNA ITS diurutake kanthi bidirectional nggunakake metode sekuensing Sanger. Urutan query sing dirakit banjur dibandhingake karo data paling anyar ing GenBank lan Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) nggunakake piranti lunak BLASTn. Urutan query dibandhingake karo 20 galur/isolat S. sclerotiorum liyane sing dijupuk saka data paling anyar ing NCBI GenBank (Tabel Tambahan S1) nggunakake ClustalW ing Paket Analisis Genetika Evolusi Molekuler (MEGA-11; versi 11) (Kumar et al., 2024). Analisis evolusi ditindakake nggunakake metode kemungkinan maksimum lan model substitusi nukleotida umum sing bisa dibalikke wektu (Nei lan Kumar, 2000). Wit kanthi kemungkinan log paling dhuwur dituduhake. Wit awal kanggo panelusuran heuristik dipilih kanthi milih wit kanthi kemungkinan log sing luwih dhuwur antarane wit tetanggan-gabungan (NJ) (Kumar et al., 2024) lan wit parsimony maksimum (MP). Wit NJ dibangun nggunakake matriks jarak berpasangan sing diitung nggunakake model umum sing bisa dibalikke wektu (Nei lan Kumar, 2000).
Aktivitas antibakteri L-ornitin lan bakterisida "Rizolex-T" ditemtokake in vitro kanthi metode difusi agar. Cara: Jupuk jumlah larutan stok L-ornitin (500 mg/L) sing cocog lan campur rata karo 10 ml medium nutrisi PDA kanggo nyiyapake larutan kanthi konsentrasi pungkasan 12,5, 25, 50, 75, 100 lan 125 mg/L. Lima konsentrasi fungisida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 lan 10 mg/L) lan banyu suling steril digunakake minangka kontrol. Sawise medium dadi padhet, sumbat miselium sing nembe disiapake saka kultur Sclerotinia sclerotiorum, diameter 4 mm, dipindhah menyang tengah cawan Petri lan dibudidayakake ing suhu 25±2°C nganti miselium nutupi kabeh cawan Petri kontrol, sawise iku pertumbuhan jamur dicathet. Hitung persentase inhibisi pertumbuhan radial S. sclerotiorum nggunakake persamaan 1:
Eksperimen iki diulang kaping pindho, kanthi enem ulangan biologis kanggo saben klompok kontrol/eksperimen lan limang pot (rong tanduran saben pot) kanggo saben ulangan biologis. Saben ulangan biologis dianalisis kaping pindho (rong ulangan teknis) kanggo njamin akurasi, linuwih, lan reproduksibilitas asil eksperimen. Kajaba iku, analisis regresi probit digunakake kanggo ngetung konsentrasi hambat setengah maksimal (IC50) lan IC99 (Prentice, 1976).
Kanggo ngevaluasi potensi L-ornitin ing kahanan omah kaca, rong eksperimen pot berturut-turut ditindakake. Secara ringkes, pot diisi lemah lempung-pasir sing wis disterilisasi (3:1) lan diinokulasi karo kultur S. sclerotiorum sing nembe disiapake. Kapisan, isolat S. sclerotiorum sing paling invasif (isolat #3) dibudidayakake kanthi ngethok siji sclerotium dadi loro, dilebokake madhep mudhun ing PDA lan diinkubasi ing suhu 25°C ing peteng terus-terusan (24 jam) sajrone 4 dina kanggo ngrangsang tuwuhing miselium. Papat sumbat agar diameter 5 mm banjur dijupuk saka pinggir ngarep lan diinokulasi karo 100 g campuran gandum lan dedak beras steril (1:1, v/v) lan kabeh labu diinkubasi ing suhu 25 ± 2 °C ing siklus cahya 12 jam/peteng 12 jam sajrone 5 dina kanggo ngrangsang pembentukan sklerotia. Isi kabeh labu dicampur kanthi tliti kanggo njamin homogenitas sadurunge nambahake lemah. Banjur, 100 g campuran dedak sing lagi kolonisasi ditambahake ing saben pot kanggo njamin konsentrasi patogen sing tetep. Pot sing wis diinokulasi disiram kanggo ngaktifake pertumbuhan jamur lan dilebokake ing kahanan omah kaca sajrone 7 dina.
Lima wiji saka varietas Giza 3 banjur disebar ing saben pot. Kanggo pot sing diobati nganggo L-ornithine lan fungisida Rizolex-T, wiji sing wis disterilisasi direndhem dhisik rong jam ing larutan banyu saka rong senyawa kasebut kanthi konsentrasi IC99 pungkasan udakara 250 mg/L lan 50 mg/L, banjur dikeringake sajrone sak jam sadurunge disebar. Ing sisih liya, wiji direndhem ing banyu suling steril minangka kontrol negatif. Sawise 10 dina, sadurunge disiram pisanan, tunas ditipisake, mung kari rong tunas sing rapi ing saben pot. Kajaba iku, kanggo njamin infeksi S. sclerotiorum, batang tanduran kacang ing tahap perkembangan sing padha (10 dina) dipotong ing rong lokasi sing beda nggunakake pisau bedah sing disterilisasi lan kira-kira 0,5 g campuran dedak sing ana koloni dilebokake ing saben tatu, banjur kelembapan sing dhuwur kanggo ngrangsang infeksi lan perkembangan penyakit ing kabeh tanduran sing diinokulasi. Tanduran kontrol uga diwènèhi tatu sing padha lan jumlah sing padha (0,5 g) campuran dedak steril sing durung dikolonisasi dilebokake ing tatu lan dijaga ing kelembapan sing dhuwur kanggo nyimulasikake lingkungan kanggo perkembangan penyakit lan njamin konsistensi antarane klompok perawatan.
Cara perawatan: Bibit kacang disiram nganggo 500 ml larutan banyu L-ornitin (250 mg/l) utawa fungisida Rizolex-T (50 mg/l) kanthi ngilekake lemah, banjur perawatan diulang kaping telu kanthi interval 10 dina. Kontrol sing diobati plasebo diilekake nganggo 500 ml banyu suling steril. Kabeh perawatan ditindakake ing kahanan omah kaca (25 ± 2°C, kelembapan relatif 75 ± 1%, lan fotoperiode 8 jam padhang/16 jam peteng). Kabeh pot disiram saben rong minggu lan diobati saben wulan nganggo pupuk NPK sing seimbang (20-20-20, kanthi 3,6% belerang lan unsur mikro TE; Zain Seeds, Mesir) kanthi konsentrasi 3-4 g/l kanthi nyemprotake godhong miturut rekomendasi kanggo varietas tartamtu lan pandhuan pabrikan. Kajaba kasebut liya, godhong diwasa sing wis thukul kanthi lengkap (godhong kaping 2 lan 3 saka ndhuwur) dikumpulake saka saben replikasi biologis ing 72 jam sawise perawatan (hpt), dihomogenisasi, dikumpulake lan disimpen ing suhu -80 °C kanggo analisis luwih lanjut kalebu, nanging ora winates ing, lokalisasi histokimia in situ saka indikator stres oksidatif, peroksidasi lipid, antioksidan enzimatik lan non-enzimatik, lan ekspresi gen.
Intensitas infeksi jamur putih ditaksir saben minggu 21 dina sawise inokulasi (dpi) nggunakake skala 1-9 (Tabel Tambahan S2) adhedhasar skala Petzoldt lan Dickson (1996) sing diowahi dening Teran et al. (2006). Secara ringkes, batang lan cabang tanduran kacang ditliti wiwit saka titik inokulasi kanggo ngetutake perkembangan lesi ing sadawane ruas lan simpul. Jarak lesi saka titik inokulasi menyang titik paling adoh ing sadawane batang utawa cabang banjur diukur lan skor 1-9 diwenehake adhedhasar lokasi lesi, ing ngendi (1) nuduhake ora ana infeksi sing katon cedhak titik inokulasi lan (2-9) nuduhake peningkatan ukuran lesi lan perkembangan bertahap ing sadawane simpul/ruas (Tabel Tambahan S2). Intensitas infeksi jamur putih banjur diowahi dadi persentase nggunakake rumus 2:
Kajaba iku, area ing sangisore kurva perkembangan penyakit (AUDPC) diitung nggunakake rumus (Shaner lan Finney, 1977), sing bubar diadaptasi kanggo busuk putih kacang buncis (Chauhan et al., 2020) nggunakake persamaan 3:
Ing ngendi Yi = keruwetan penyakit ing wektu ti, Yi+1 = keruwetan penyakit ing wektu sabanjure ti+1, ti = wektu pangukuran pisanan (sajrone dina), ti+1 = wektu pangukuran sabanjure (sajrone dina), n = jumlah total titik wektu utawa titik pengamatan. Parameter pertumbuhan tanduran kacang buncis kalebu dhuwur tanduran (cm), jumlah cabang saben tanduran, lan jumlah godhong saben tanduran dicathet saben minggu sajrone 21 dina ing kabeh ulangan biologis.
Ing saben replikasi biologis, sampel godhong (godhong kapindho lan katelu sing wis berkembang lengkap saka ndhuwur) dikumpulake ing dina kaping 45 sawise perawatan (15 dina sawise perawatan pungkasan). Saben replikasi biologis kasusun saka limang pot (rong tanduran saben pot). Kira-kira 500 mg jaringan sing diremuk digunakake kanggo ekstraksi pigmen fotosintetik (klorofil a, klorofil b lan karotenoid) nggunakake 80% aseton ing suhu 4 °C ing peteng. Sawise 24 jam, sampel disentrifugasi lan supernatan dikumpulake kanggo nemtokake isi klorofil a, klorofil b lan karotenoid kanthi kolorimetri nggunakake spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) miturut metode (Lichtenthaler, 1987) kanthi ngukur absorbansi ing telung dawa gelombang sing beda (A470, A646 lan A663 nm). Pungkasan, isi pigmen fotosintetik diitung nggunakake rumus ing ngisor iki 4-6 sing diterangake dening Lichtenthaler (1987).
Ing 72 jam sawise perawatan (hpt), godhong (godhong kapindho lan katelu sing wis berkembang lengkap saka ndhuwur) dikumpulake saka saben replikasi biologis kanggo lokalisasi histokimia in situ hidrogen peroksida (H2O2) lan anion superoksida (O2•−). Saben replikasi biologis kasusun saka limang pot (rong tanduran saben pot). Saben replikasi biologis dianalisis kanthi duplikat (rong replikasi teknis) kanggo njamin akurasi, linuwih, lan reproduksibilitas metode kasebut. H2O2 lan O2•− ditemtokake nggunakake 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) utawa nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), miturut metode sing diterangake dening Romero-Puertas et al. (2004) lan Adam et al. (1989) kanthi modifikasi cilik. Kanggo lokalisasi histokimia H2O2 in situ, leaflet diinfiltrasi vakum nganggo 0,1% DAB ing 10 mM buffer Tris (pH 7,8) banjur diinkubasi ing suhu kamar ing cahya sajrone 60 menit. Leaflet diputihake ing 0,15% (v/v) TCA ing 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir) banjur kapapar cahya nganti peteng. Kajaba iku, katup diinfiltrasi vakum nganggo 10 mM buffer kalium fosfat (pH 7,8) sing ngemot 0,1 w/v % HBT kanggo lokalisasi histokimia O2•− in situ. Leaflet diinkubasi ing cahya ing suhu kamar sajrone 20 menit, banjur diputihake kaya ing ndhuwur, banjur disinari nganti bintik biru/ungu peteng katon. Intensitas warna coklat (minangka indikator H2O2) utawa biru-ungu (minangka indikator O2•−) sing diasilake ditaksir nggunakake versi Fiji saka paket pangolahan gambar ImageJ (http://fiji.sc; diakses 7 Maret 2024).
Malondialdehida (MDA; minangka penanda peroksidasi lipid) ditemtokake miturut metode Du lan Bramlage (1992) kanthi modifikasi tipis. Godhong saka saben replikasi biologis (godhong kapindho lan katelu sing wis berkembang lengkap saka ndhuwur) dikumpulake 72 jam sawise perawatan (hpt). Saben replikasi biologis kalebu limang pot (rong tanduran saben pot). Saben replikasi biologis dianalisis kanthi duplikat (rong replikasi teknis) kanggo njamin akurasi, linuwih, lan reproduksibilitas metode kasebut. Cekakipun, 0,5 g jaringan godhong sing wis digiling digunakake kanggo ekstraksi MDA kanthi 20% asam trikloroasetat (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) sing ngemot 0,01% butil hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kandungan MDA ing supernatan banjur ditemtokake sacara kolorimetri kanthi ngukur absorbansi ing 532 lan 600 nm nggunakake spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) banjur dinyatakake minangka nmol g−1 FW.
Kanggo penilaian antioksidan non-enzimatik lan enzimatik, godhong (godhong kapindho lan katelu sing wis berkembang lengkap saka ndhuwur) dikumpulake saka saben replikasi biologis 72 jam sawise perawatan (hpt). Saben replikasi biologis kasusun saka limang pot (rong tanduran saben pot). Saben sampel biologis dianalisis kanthi duplikat (rong sampel teknis). Rong godhong digiling nganggo nitrogen cair lan digunakake langsung kanggo nemtokake antioksidan enzimatik lan non-enzimatik, total asam amino, kandungan prolin, ekspresi gen, lan kuantifikasi oksalat.
Total fenolik sing larut ditemtokake nggunakake reagen Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kanthi modifikasi tipis saka metode sing diterangake dening Kahkonen et al. (1999). Secara ringkes, kira-kira 0,1 g jaringan godhong sing dihomogenisasi diekstrak nganggo 20 ml metanol 80% ing peteng sajrone 24 jam lan supernatan dikumpulake sawise sentrifugasi. 0,1 ml ekstrak sampel dicampur karo 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu (10%), dikocok sajrone 30 detik lan ditinggal ing peteng sajrone 5 menit. Banjur 0,5 ml larutan natrium karbonat 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Mesir) ditambahake ing saben tabung, dicampur kanthi tliti lan diinkubasi ing suhu kamar ing peteng sajrone 1 jam. Sawisé inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur ing 765 nm nggunakaké spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi fenol larut total ing ekstrak sampel ditemtokake nggunakaké kurva kalibrasi asam galat (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) lan dinyatakaké minangka miligram setara asam galat saben gram bobot seger (mg GAE g-1 bobot seger).
Kandungan flavonoid larut total ditemtokake miturut metode Djeridane et al. (2006) kanthi modifikasi sithik. Secara ringkes, 0,3 ml ekstrak metanol ing ndhuwur dicampur karo 0,3 ml larutan aluminium klorida 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), diaduk kanthi kuat banjur diinkubasi ing suhu ruangan suwene 5 menit, banjur ditambahake 0,3 ml larutan kalium asetat 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir), dicampur kanthi tliti lan diinkubasi ing suhu ruangan suwene 30 menit ing peteng. Sawise inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur ing 430 nm nggunakake spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi flavonoid larut total ing ekstrak sampel ditemtokake nggunakake kurva kalibrasi rutin (TCI America, Portland, OR, USA) banjur dinyatakake minangka miligram setara rutin saben gram bobot seger (mg RE g-1 bobot seger).
Kandungan asam amino bebas total godhong kacang ditemtokake nggunakake reagen ninhidrin sing dimodifikasi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) adhedhasar metode sing diusulake dening Yokoyama lan Hiramatsu (2003) lan dimodifikasi dening Sun et al. (2006). Secara ringkes, 0,1 g jaringan sing wis digiling diekstrak nganggo buffer pH 5,4, lan 200 μL supernatan direaksikake karo 200 μL ninhidrin (2%) lan 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), diinkubasi ing bak banyu sing umob sajrone 30 menit, banjur didinginkan lan diukur ing 580 nm nggunakake spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Ing sisih liya, prolin ditemtokake kanthi metode Bates (Bates et al., 1973). Prolin diekstrak nganggo asam sulfosalisilat 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) lan sawise sentrifugasi, 0,5 ml supernatan dicampur karo 1 ml asam asetat glasial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) lan reagen ninhidrin, diinkubasi ing suhu 90°C suwene 45 menit, didinginkan lan diukur ing 520 nm nggunakake spektrofotometer sing padha karo ing ndhuwur. Total asam amino bebas lan prolin ing ekstrak godhong ditemtokake nggunakake kurva kalibrasi glisin lan prolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), lan dinyatakake minangka mg/g bobot seger.
Kanggo nemtokake aktivitas enzimatik enzim antioksidan, kira-kira 500 mg jaringan sing dihomogenisasi diekstrak nganggo 3 ml buffer Tris 50 mM (pH 7,8) sing ngemot 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lan 7,5% polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), disentrifugasi ing 10.000 × g sajrone 20 menit ing kulkas (4 °C), lan supernatan (ekstrak enzim mentah) dikumpulake (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) banjur direaksikake karo 2 ml buffer natrium fosfat 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lan 100 μl larutan H2O2 269 mM kanggo nemtokake aktivitas enzimatik miturut metode Aebi (1984) kanthi modifikasi tipis (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Aktivitas enzimatik peroksidase sing gumantung karo Guaiacol (POX) ditemtokake nggunakake metode Harrach et al. (2009). (2008) kanthi modifikasi cilik (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) lan aktivitas enzimatik polifenol oksidase (PPO) ditemtokake sawise reaksi karo 2,2 ml 100 mM buffer natrium fosfat (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) lan 100 μl 12 mM H2O2. Metode iki rada dimodifikasi saka (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Uji coba ditindakake sawise reaksi karo 3 ml larutan katekol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) sing disiapake kanthi seger ing 0,1 M buffer fosfat (pH 6,0). Aktivitas CAT diukur kanthi ngawasi dekomposisi H2O2 ing 240 nm (A240), aktivitas POX diukur kanthi ngawasi paningkatan absorbansi ing 436 nm (A436), lan aktivitas PPO diukur kanthi nyathet fluktuasi absorbansi ing 495 nm (A495) saben 30 detik sajrone 3 menit nggunakake spektrofotometer UV-160A (Shimadzu, Jepang).
RT-PCR wektu nyata digunakake kanggo ndeteksi tingkat transkrip saka telung gen sing ana gandhengane karo antioksidan, kalebu katalase peroksisomal (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoksida dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), lan glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), ing godhong kacang (godhong kapindho lan katelu sing wis berkembang lengkap saka ndhuwur) 72 jam sawise perawatan pungkasan. Secara ringkes, RNA diisolasi nggunakake Kit Ekstraksi RNA Total Simply P (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) miturut protokol pabrikan. Banjur, cDNA disintesis nggunakake Kit Sintesis cDNA TOP script™ miturut pandhuan pabrikan. Urutan primer saka telung gen ing ndhuwur kadhaptar ing Tabel Tambahan S3. PvActin-3 (nomer aksesi GenBank: XM_068616709.1) digunakake minangka gen pengelola lan ekspresi gen relatif diitung nggunakake metode 2-ΔΔCT (Livak lan Schmittgen, 2001). Stabilitas aktin ing stres biotik (interaksi sing ora kompatibel antarane kacang-kacangan umum lan jamur antraknosa Colletotrichum lindemuthianum) lan stres abiotik (kekeringan, salinitas, suhu rendah) wis dituduhake (Borges et al., 2012).
Wiwitane, kita nindakake analisis in silico genom saka protein oksaloasetat asetilhidrolase (OAH) ing S. sclerotiorum nggunakake alat BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Cekakipun, kita nggunakake OAH saka Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nomer aksesi GenBank XP_040799428.1; 342 asam amino) lan Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nomer aksesi GenBank XP_056833920.1; 316 asam amino) minangka urutan query kanggo memetakan protein homolog ing S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp ditindakake nglawan data genom S. sclerotiorum paling anyar sing kasedhiya ing GenBank ing situs web Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Kajaba iku, gen OAH sing diprediksi saka S. sclerotiorum (SsOAH) lan analisis evolusioner lan wit filogenetik AfOAH saka A. fijiensis CBS 313.89 lan PlOAH saka P. lagena disimpulake nggunakake metode kemungkinan maksimum ing MEGA11 (Tamura et al., 2021) lan model berbasis matriks JTT (Jones et al., 1992). Wit filogenetik digabungake karo analisis penyelarasan ganda saka urutan protein kabeh gen OAH sing diprediksi (SsOAH) saka S. sclerotiorum lan urutan query nggunakake Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos lan Agarwala, 2007). Kajaba iku, urutan asam amino SsOAH sing paling cocog saka S. sclerotiorum diselarasake karo urutan query (AfOAH lan PlOAH) (Larkin et al., 2007) nggunakake ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), lan wilayah sing dilestarikake ing alignment divisualisasikake nggunakake alat ESPript (versi 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Salajengipun, domain representatif fungsional sing diprediksi lan situs sing dilestarikake saka S. sclerotiorum SsOAH diklasifikasikake kanthi interaktif menyang kulawarga sing beda-beda nggunakake alat InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Pungkasan, pemodelan struktur telung dimensi (3D) saka S. sclerotiorum SsOAH sing diprediksi ditindakake nggunakake Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 versi 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) lan divalidasi nggunakake server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Struktur telung dimensi sing diprediksi (format PDB) divisualisasikake kanthi interaktif nggunakake paket UCSF-Chimera (versi 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR fluoresensi wektu nyata kuantitatif digunakake kanggo nemtokake tingkat transkripsi oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH; nomer aksesi GenBank: XM_001590428.1) ing miselium Sclerotinia sclerotiorum. Cekakipun, S. sclerotiorum diinokulasi menyang labu sing ngemot PDB lan dilebokake ing inkubator sing digoyang (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ing suhu 25 ± 2 °C sajrone 24 jam kanthi kecepatan 150 rpm lan ing peteng sing terus-terusan (24 jam) kanggo ngrangsang tuwuhing miselium. Sawise iku, sel-sel kasebut diobati nganggo L-ornitin lan fungisida Rizolex-T ing konsentrasi IC50 pungkasan (kurang luwih 40 lan 3,2 mg/L, masing-masing) banjur dikultur sajrone 24 jam maneh ing kahanan sing padha. Sawise inkubasi, kultur disentrifugasi kanthi kecepatan 2500 rpm suwene 5 menit lan supernatan (miselium jamur) dikumpulake kanggo analisis ekspresi gen. Kajaba iku, miselium jamur dikumpulake ing 0, 24, 48, 72, 96, lan 120 jam sawise infeksi saka tanduran sing kena infeksi sing wis mbentuk jamur putih lan miselium katun ing permukaan jaringan sing kena infeksi. RNA diekstrak saka miselium jamur banjur cDNA disintesis kaya sing diterangake ing ndhuwur. Urutan primer kanggo SsOAH kadhaptar ing Tabel Tambahan S3. SsActin (nomer aksesi GenBank: XM_001589919.1) digunakake minangka gen housekeeping, lan ekspresi gen relatif diitung nggunakake metode 2-ΔΔCT (Livak lan Schmittgen, 2001).
Asam oksalat ditemtokake ing duduh kaldu dekstrosa kentang (PDB) lan sampel tanduran sing ngemot patogen jamur Sclerotinia sclerotiorum miturut metode Xu lan Zhang (2000) kanthi modifikasi sithik. Secara ringkes, isolat S. sclerotiorum diinokulasi menyang labu sing ngemot PDB banjur dibudidayakake ing inkubator sing diocok (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) kanthi kecepatan 150 rpm ing suhu 25 ± 2 °C sajrone 3-5 dina ing peteng sing terus-terusan (24 jam) kanggo ngrangsang pertumbuhan miselium. Sawise inkubasi, kultur jamur pisanan disaring liwat kertas saring Whatman #1 banjur disentrifugasi kanthi kecepatan 2500 rpm sajrone 5 menit kanggo mbusak miselium sing isih ana. Supernatan dikumpulake lan disimpen ing suhu 4 °C kanggo nemtokake kuantitatif oksalat luwih lanjut. Kanggo nyiapake sampel tanduran, kira-kira 0,1 g fragmen jaringan tanduran diekstrak kaping telu nganggo banyu suling (2 ml saben wektu). Sampel banjur disentrifugasi kanthi kecepatan 2500 rpm suwene 5 menit, supernatan disaring garing nganggo kertas saring Whatman No. 1 lan dikumpulake kanggo analisis luwih lanjut.
Kanggo analisis kuantitatif asam oksalat, campuran reaksi disiapake ing tabung kaca sing ditutup kanthi urutan ing ngisor iki: 0,2 ml sampel (utawa filtrat kultur PDB utawa larutan standar asam oksalat), 0,11 ml bromofenol biru (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml asam sulfat 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir) lan 0,176 ml 100 mM kalium dikromat (K2Cr2O7; bahan kimia TCI, Portland, OR, USA), banjur larutan kasebut diencerake dadi 4,8 ml nganggo banyu suling, dicampur kanthi kuat lan langsung dilebokake ing bak banyu 60 °C. Sawise 10 menit, reaksi kasebut dihentikan kanthi nambahake 0,5 ml larutan natrium hidroksida (NaOH; 0,75 M). Absorbansi (A600) saka campuran reaksi diukur ing 600 nm nggunakake spektrofotometer UV-160 (Shimadzu Corporation, Jepang). PDB lan banyu suling digunakake minangka kontrol kanggo kuantifikasi filtrat kultur lan sampel tanduran. Konsentrasi asam oksalat ing filtrat kultur, sing dinyatakake minangka mikrogram asam oksalat saben mililiter medium PDB (μg.mL−1), lan ing ekstrak godhong, sing dinyatakake minangka mikrogram asam oksalat saben gram bobot seger (μg.g−1 FW), ditemtokake nggunakake kurva kalibrasi asam oksalat (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sajrone panliten, kabeh eksperimen dirancang kanthi desain acak lengkap (CRD) kanthi enem ulangan biologis saben perawatan lan limang pot saben ulangan biologis (rong tanduran saben pot) kajaba ana katrangan liya. Replikasi biologis dianalisis kanthi duplikat (rong ulangan teknis). Replikasi teknis digunakake kanggo mriksa reproduksibilitas eksperimen sing padha nanging ora digunakake ing analisis statistik kanggo nyegah ulangan palsu. Data dianalisis sacara statistik nggunakake analisis varians (ANOVA) banjur uji bedane sing signifikan sacara jujur ​​(HSD) Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Kanggo eksperimen in vitro, nilai IC50 lan IC99 diitung nggunakake model probit lan interval kapercayan 95% diitung.
Ana papat isolat sing dikumpulake saka macem-macem kebon kedele ing Provinsi El Ghabiya, Mesir. Ing medium PDA, kabeh isolat ngasilake miselium putih krem ​​sing cepet malih dadi putih kapas (Gambar 1A) banjur dadi krem ​​utawa coklat ing tahap sklerotium. Sklerotia biasane kandhel, ireng, bunder utawa ora teratur bentuke, dawane 5,2 nganti 7,7 mm lan diametere 3,4 nganti 5,3 mm (Gambar 1B). Sanajan papat isolat ngembangake pola sklerotia marginal ing pinggir medium kultur sawise 10-12 dina inkubasi ing suhu 25 ± 2 °C (Gambar 1A), jumlah sklerotia saben piring beda banget ing antarane (P < 0,001), kanthi isolat 3 duwe jumlah sklerotia paling dhuwur (32,33 ± 1,53 sklerotia saben piring; Gambar 1C). Semono uga, isolat #3 ngasilake asam oksalat luwih akeh ing PDB tinimbang isolat liyane (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Gambar 1D). Isolat #3 nuduhake karakteristik morfologis lan mikroskopis khas jamur fitopatogen Sclerotinia sclerotiorum. Contone, ing PDA, koloni isolat #3 tuwuh kanthi cepet, putih krem ​​(Gambar 1A), warna beige terbalik utawa salmon kuning-coklat enom, lan mbutuhake 6-7 dina ing suhu 25 ± 2°C kanggo nutupi permukaan piring diameter 9 cm kanthi lengkap. Adhedhasar karakteristik morfologis lan mikroskopis ing ndhuwur, isolat #3 diidentifikasi minangka Sclerotinia sclerotiorum.
Gambar 1. Karakteristik lan patogenisitas isolat S. sclerotiorum saka tanduran legum umum. (A) Pertumbuhan miselium saka papat isolat S. sclerotiorum ing medium PDA, (B) sklerotia saka papat isolat S. sclerotiorum, (C) jumlah sklerotia (per piring), (D) sekresi asam oksalat ing medium PDB (μg.mL−1), lan (E) keruwetan penyakit (%) saka papat isolat S. sclerotiorum ing kultivar legum komersial sing rentan Giza 3 ing kahanan omah kaca. Nilai kasebut makili rata-rata ± SD saka limang ulangan biologis (n = 5). Huruf sing beda nuduhake beda sing signifikan sacara statistik antarane perawatan (p < 0,05). (F–H) Gejala jamur putih khas katon ing batang lan silique ing ndhuwur lemah, masing-masing, 10 dina sawise inokulasi karo isolat #3 (dpi). (I) Analisis evolusi wilayah spacer transkripsi internal (ITS) saka isolat S. sclerotiorum #3 ditindakake nggunakake metode kemungkinan maksimum lan dibandhingake karo 20 isolat/galur referensi sing dipikolehi saka basis data Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Angka-angka ing ndhuwur garis kluster nuduhake jangkoan wilayah (%), lan angka-angka ing ngisor garis kluster nuduhake dawa cabang.
Salajengipun, kangge ngonfirmasi patogenisitas, papat isolat S. sclerotiorum ingkang dipunpendhet dipunginakaken kangge nyuntik kultivar kacang komersial Giza 3 ingkang rentan ing kahanan griya ijo, ingkang konsisten kaliyan postulat Koch (Gambar 1E). Sanajan sedaya isolat jamur ingkang dipunpendhet patogen lan saged nginfeksi kacang ijo (cv. Giza 3), nyebabaken gejala jamur putih khas ing sedaya bagean ing ndhuwur lemah (Gambar 1F), utaminipun ing batang (Gambar 1G) lan polong (Gambar 1H) ing 10 dinten sasampunipun inokulasi (dpi), isolat 3 minangka isolat paling agresif ing kalih eksperimen independen. Isolat 3 gadhah tingkat keruwetan penyakit paling inggil (%) ing tanduran kacang (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, lan 76,7 ± 3,1 ing 7, 14, lan 21 dinten sasampunipun infeksi; Gambar 1F).
Identifikasi isolat S. sclerotiorum #3 sing paling invasif luwih dikonfirmasi adhedhasar sekuensing spacer transkripsi internal (ITS) (Gambar 1I). Analisis filogenetik antarane isolat #3 lan 20 isolat/galur referensi nuduhake kamiripan sing dhuwur (>99%) ing antarane. Perlu dicathet yen isolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) nduweni kamiripan sing dhuwur karo isolat S. sclerotiorum Amerika LPM36 sing diisolasi saka wiji kacang polong garing (nomer aksesi GenBank MK896659.1; 540 bp) lan isolat S. sclerotiorum Cina YKY211 (nomer aksesi GenBank OR206374.1; 548 bp), sing nyebabake busuk batang violet (Matthiola incana), sing kabeh dikelompokake kanthi kapisah ing sisih ndhuwur dendrogram (Gambar 1I). Urutan anyar iki wis disimpen ing basis data NCBI lan dijenengi "Sclerotinia sclerotiorum - isolat YN-25" (nomer aksesi GenBank PV202792). Bisa dideleng yen isolat 3 minangka isolat sing paling invasif; mula, isolat iki dipilih kanggo ditliti ing kabeh eksperimen sabanjure.
Aktivitas antibakteri saka diamine L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) ing konsentrasi sing beda-beda (12,5, 25, 50, 75, 100 lan 125 mg/L) marang isolat S. sclerotiorum 3 wis diselidiki in vitro. Perlu dicathet yen L-ornitin nduweni efek antibakteri lan mboko sithik nyegah pertumbuhan radial hifa S. sclerotiorum kanthi cara sing gumantung dosis (Gambar 2A, B). Ing konsentrasi paling dhuwur sing dites (125 mg/L), L-ornitin nuduhake tingkat inhibisi pertumbuhan miselium paling dhuwur (99,62 ± 0,27%; Gambar 2B), sing padha karo fungisida komersial Rizolex-T (tingkat inhibisi 99,45 ± 0,39%; Gambar 2C) ing konsentrasi paling dhuwur sing dites (10 mg/L), sing nuduhake khasiat sing padha.
Gambar 2. Aktivitas antibakteri in vitro L-ornitinia nglawan Sclerotinia sclerotiorum. (A) Perbandingan aktivitas antibakteri saka konsentrasi L-ornitin sing beda-beda nglawan S. sclerotiorum karo fungisida komersial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tingkat penghambatan (%) pertumbuhan miselium S. sclerotiorum sawise perawatan karo konsentrasi L-ornitin sing beda-beda (12,5, 25, 50, 75, 100 lan 125 mg/L) utawa Rizolex-T (2, 4, 6, 8 lan 10 mg/L). Nilai kasebut makili rata-rata ± SD saka limang ulangan biologis (n = 5). Huruf sing beda-beda nuduhake beda statistik antarane perawatan (p < 0,05). (D, E) Analisis regresi model Probit saka L-ornitin lan fungisida komersial Rizolex-T. Garis regresi model probit dituduhake minangka garis biru polos, lan interval kapercayan (95%) dituduhake minangka garis abang putus-putus.
Kajaba iku, analisis regresi probit ditindakake lan plot sing cocog dituduhake ing Tabel 1 lan Gambar 2D, E. Secara ringkes, nilai lereng sing bisa ditampa (y = 2.92x − 4.67) lan statistik signifikan sing ana gandhengane (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 lan p < 0.0001; Gambar 2D) saka L-ornithine nuduhake aktivitas antijamur sing luwih dhuwur marang S. sclerotiorum dibandhingake karo fungisida komersial Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 lan p < 0.0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Nilai konsentrasi hambat setengah maksimum (IC50) lan IC99 (mg/l) L-ornitin lan fungisida komersial "Rizolex-T" nglawan S. sclerotiorum.
Sakabèhé, L-ornitin (250 mg/L) nyuda perkembangan lan keruwetan jamur putih ing tanduran kacang buncis sing diobati dibandhingake karo tanduran sing kena infeksi S. sclerotiorum sing ora diobati (kontrol; Gambar 3A). Sacara ringkes, sanajan keruwetan penyakit tanduran kontrol sing kena infeksi sing ora diobati saya tambah (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, lan 92,33 ± 3,06%), L-ornitin nyuda keruwetan penyakit (%) kanthi signifikan sajrone eksperimen (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, lan 26,36 ± 3,07) ing 7, 14, lan 21 dina sawise perawatan (dpt), masing-masing (Gambar 3A). Semono uga, nalika tanduran kacang buncis sing kena infeksi S. sclerotiorum diobati nganggo 250 mg/L L-ornitin, area ing sangisore kurva perkembangan penyakit (AUDPC) mudhun saka 1274,33 ± 33,13 ing kontrol sing ora diobati dadi 281,03 ± 7,95, sing rada luwih murah tinimbang kontrol positif 50 mg/L fungisida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Gambar 3B). Tren sing padha diamati ing eksperimen kapindho.
Gambar 3. Efek aplikasi eksogen L-ornitin marang perkembangan bosok putih kacang buncis sing disebabake dening Sclerotinia sclerotiorum ing kahanan omah kaca. (A) Kurva perkembangan penyakit jamur putih kacang buncis sawise perawatan nganggo 250 mg/L L-ornitin. (B) Area ing kurva perkembangan penyakit (AUDPC) jamur putih kacang buncis sawise perawatan nganggo L-ornitin. Nilai kasebut makili rata-rata ± SD saka limang ulangan biologis (n = 5). Huruf sing beda-beda nuduhake beda sing signifikan sacara statistik antarane perawatan (p < 0,05).
Aplikasi eksogen 250 mg/L L-ornitin mboko sithik nambah dhuwur tanduran (Gambar 4A), jumlah cabang saben tanduran (Gambar 4B), lan jumlah godhong saben tanduran (Gambar 4C) sawise 42 dina. Nalika fungisida komersial Rizolex-T (50 mg/L) nduweni efek paling gedhe ing kabeh parameter nutrisi sing ditliti, aplikasi eksogen 250 mg/L L-ornitin nduweni efek paling gedhe nomer loro dibandhingake karo kontrol sing ora diobati (Gambar 4A–C). Ing sisih liya, perawatan L-ornitin ora nduweni efek sing signifikan marang isi pigmen fotosintetik klorofil a (Gambar 4D) lan klorofil b (Gambar 4E), nanging rada nambah isi karotenoid total (0,56 ± 0,03 mg/g bobot saben dina) dibandhingake karo kontrol negatif (0,44 ± 0,02 mg/g bobot saben dina) lan kontrol positif (0,46 ± 0,02 mg/g bobot saben dina; Gambar 4F). Sakabèhé, asil iki nuduhaké yèn L-ornitin ora fitotoksik kanggo kacang-kacangan sing diolah lan malah bisa ngrangsang tuwuhé.
Gambar 4. Efek aplikasi L-ornitin eksogen marang karakteristik pertumbuhan lan pigmen fotosintesis godhong kacang sing kena infeksi Sclerotinia sclerotiorum ing kahanan omah kaca. (A) Dhuwur tanduran (cm), (B) Cacah cabang saben tanduran, (C) Cacah godhong saben tanduran, (D) Kandungan klorofil a (mg g-1 fr wt), (E) Kandungan klorofil b (mg g-1 fr wt), (F) Total kandungan karotenoid (mg g-1 fr wt). Nilai kasebut minangka rata-rata ± SD saka limang ulangan biologis (n = 5). Huruf sing beda nuduhake beda sing signifikan sacara statistik antarane perawatan (p < 0,05).
Lokalisasi histokimia in situ saka spesies oksigen reaktif (ROS; dinyatakake minangka hidrogen peroksida [H2O2]) lan radikal bebas (nyatakake minangka anion superoksida [O2•−]) nuduhake yen aplikasi eksogen L-ornitin (250 mg/L) kanthi signifikan nyuda akumulasi H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Gambar 5A) lan O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Gambar 5B) dibandhingake karo akumulasi tanduran sing kena infeksi sing ora diobati (173,31 ± 12,06 lan 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, masing-masing) lan tanduran sing diobati nganggo 50 mg/L fungisida komersial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 lan 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, masing-masing) ing 72 jam. Kadar H2O2 lan O2•− sing dhuwur nglumpuk ing sangisore hpt (Gambar 5A, B). Kajaba iku, uji malondialdehida (MDA) adhedhasar TCA nuduhake yen tanduran kacang sing kena infeksi S. sclerotiorum nglumpukake tingkat MDA sing luwih dhuwur (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) ing godhonge (Gambar 5C). Nanging, aplikasi eksogen L-ornitin nyuda peroksidasi lipid kanthi signifikan kaya sing dibuktekake dening penurunan kandungan MDA ing tanduran sing diobati (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Gambar 5. Efek aplikasi L-ornitin eksogen marang penanda utama stres oksidatif lan mekanisme pertahanan antioksidan non-enzimatik ing godhong kacang sing kena infeksi S. sclerotiorum ing 72 jam sawise infeksi ing kahanan omah kaca. (A) Hidrogen peroksida (H2O2; nmol g−1 FW) ing 72 hpt, (B) anion superoksida (O2•−; nmol g−1 FW) ing 72 hpt, (C) malondialdehida (MDA; nmol g−1 FW) ing 72 hpt, (D) total fenol sing larut (mg GAE g−1 FW) ing 72 hpt, (E) total flavonoid sing larut (mg RE g−1 FW) ing 72 hpt, (F) total asam amino bebas (mg g−1 FW) ing 72 hpt, lan (G) kandungan prolin (mg g−1 FW) ing 72 hpt. Nilai-nilai kasebut nggambarake rata-rata ± deviasi standar (rata-rata ± SD) saka 5 ulangan biologis (n = 5). Huruf sing beda-beda nuduhake beda sing signifikan sacara statistik antarane perawatan (p < 0,05).