Teori pertahanan tanduran sing beda-beda menehi pandhuan teoretis sing penting kanggo njelasake pola metabolisme khusus tanduran, nanging prediksi utama isih kudu diuji. Ing kene, kita nggunakake analisis spektrometri massa tandem (MS/MS) sing ora bias kanggo njelajah kanthi sistematis metabolit galur tembakau sing dilemahake saka tanduran individu menyang populasi lan spesies sing raket banget, lan ngolah akeh teori fitur spektrometri massa adhedhasar spektrum senyawa ing informasi. Kerangka kerja kanggo nguji prediksi utama teori pertahanan optimal (OD) lan target obah (MT). Komponen informasi metabolomik tanduran konsisten karo teori OD, nanging mbantah prediksi utama teori MT babagan dinamika metabolomik sing disebabake dening herbivora. Saka skala evolusi mikro nganti makro, sinyal jasmonat diidentifikasi minangka penentu utama OD, dene sinyal etilen nyedhiyakake penyetelan respon spesifik herbivora sing dianotasi dening jaringan molekuler MS/MS.
Metabolit khusus kanthi struktur sing maneka warna minangka peserta utama ing adaptasi tanduran marang lingkungan, utamane kanggo mbela mungsuh (1). Diversifikasi metabolisme khusus sing apik banget sing ditemokake ing tanduran wis ngrangsang riset jero sajrone pirang-pirang dekade babagan akeh aspek fungsi ekologis, lan wis mbentuk dhaptar dawa teori pertahanan tanduran, yaiku pangembangan evolusioner lan ekologis interaksi tanduran-serangga. Riset empiris menehi pandhuan penting (2). Nanging, teori pertahanan tanduran iki ora ngetutake jalur normatif penalaran deduktif hipotetis, ing ngendi prediksi kunci ana ing tingkat analisis sing padha (3) lan diuji kanthi eksperimen kanggo maju siklus pangembangan teoretis sabanjure (4). Watesan teknis mbatesi pangumpulan data kanggo kategori metabolik tartamtu lan ngilangi analisis komprehensif metabolit khusus, saengga nyegah perbandingan antar kategori sing penting kanggo pangembangan teoretis (5). Kurange data metabolomik sing komprehensif lan mata uang umum kanggo mbandhingake alur kerja pangolahan ruang metabolik antarane klompok tanduran sing beda-beda ngalangi kematangan ilmiah lapangan kasebut.
Perkembangan paling anyar ing babagan metabolomik spektrometri massa tandem (MS/MS) bisa kanthi komprehensif nggambarake owah-owahan metabolisme ing njero lan antarane spesies saka klad sistem tartamtu, lan bisa digabungake karo metode komputasi kanggo ngetung kamiripan struktural antarane campuran kompleks iki. Kawruh sadurunge babagan kimia (5). Kombinasi teknologi canggih ing analisis lan komputasi nyedhiyakake kerangka kerja sing dibutuhake kanggo uji coba jangka panjang saka akeh prediksi sing digawe dening teori ekologis lan evolusioner babagan keragaman metabolik. Shannon (6) ngenalake teori informasi kanggo pisanan ing artikel penting ing taun 1948, sing dadi pondasi kanggo analisis matematika informasi, sing wis digunakake ing pirang-pirang bidang liyane saka aplikasi asline. Ing genomik, teori informasi wis kasil diterapake kanggo ngukur informasi konservatif urutan (7). Ing riset transkriptomik, teori informasi nganalisa owah-owahan sakabèhé ing transkriptomik (8). Ing riset sadurunge, kita ngetrapake kerangka kerja statistik teori informasi kanggo metabolomik kanggo njlèntrèhaké keahlian metabolik tingkat jaringan ing tanduran (9). Ing kene, kita nggabungake alur kerja berbasis MS/MS karo kerangka statistik teori informasi, sing ditondoi dening keragaman metabolik ing mata uang umum, kanggo mbandhingake prediksi kunci teori pertahanan tanduran saka metabolit sing diinduksi dening herbivora.
Kerangka teoretis pertahanan tanduran biasane saling inklusif lan bisa dipérang dadi rong kategori: sing nyoba njelasake distribusi metabolit spesifik tanduran adhedhasar fungsi pertahanan, kayata pertahanan optimal (OD) (10), target obah (MT) (11)) Lan teori penampilan (12), dene liyane nggoleki panjelasan mekanik babagan kepiye owah-owahan kasedhiyan sumber daya mengaruhi pertumbuhan tanduran lan akumulasi metabolit khusus, kayata karbon: hipotesis keseimbangan nutrisi (13), hipotesis tingkat pertumbuhan (14), lan hipotesis keseimbangan pertumbuhan lan diferensiasi (15). Rong set teori kasebut ana ing tingkat analisis sing beda (4). Nanging, rong teori sing nglibatake fungsi pertahanan ing tingkat fungsional ndominasi obrolan babagan pertahanan konstitutif lan induksi tanduran: teori OD, sing nganggep manawa tanduran nandur modal ing pertahanan kimia sing larang mung nalika dibutuhake, contone, nalika dicerna. Nalika kewan suket nyerang, mula, miturut kemungkinan serangan ing mangsa ngarep, senyawa kanthi fungsi pertahanan ditugasake (10); Hipotesis MT ngusulake yen ora ana sumbu owah-owahan metabolit arah, nanging metabolit kasebut owah kanthi acak, saengga nggawe kemungkinan Ngalangi "target gerakan" metabolik saka herbivora sing nyerang. Kanthi tembung liya, rong teori iki nggawe prediksi sing ngelawan babagan remodeling metabolik sing kedadeyan sawise serangan herbivora: hubungan antarane akumulasi metabolit searah karo fungsi pertahanan (OD) lan owah-owahan metabolik sing ora diarahake (MT) (11).
Hipotesis OD lan MT ora mung nglibatake owah-owahan sing diinduksi ing metabolit, nanging uga akibat ekologis lan evolusioner saka akumulasi metabolit kasebut, kayata biaya adaptif lan keuntungan saka owah-owahan metabolik iki ing lingkungan ekologis tartamtu (16). Sanajan loro hipotesis kasebut ngenali fungsi pertahanan metabolit khusus, sing bisa uga larang utawa ora, prediksi utama sing mbedakake hipotesis OD lan MT dumunung ing arah owah-owahan metabolik sing diinduksi. Prediksi teori OD wis nampa perhatian eksperimental paling akeh nganti saiki. Tes kasebut kalebu sinau babagan fungsi pertahanan langsung utawa ora langsung saka jaringan sing beda-beda saka senyawa tartamtu ing omah kaca lan kahanan alam, uga owah-owahan ing tahap perkembangan tanduran (17-19). Nanging, nganti saiki, amarga kekurangan alur kerja lan kerangka kerja statistik kanggo analisis komprehensif global babagan keragaman metabolik organisme apa wae, prediksi bedane utama antarane rong teori kasebut (yaiku, arah owah-owahan metabolik) isih kudu diuji. Ing kene, kita nyedhiyakake analisis kasebut.
Salah sawijining ciri sing paling penting saka metabolit spesifik tanduran yaiku keragaman struktural sing ekstrem ing kabeh tingkat saka tanduran tunggal, populasi nganti spesies sing padha (20). Akeh owah-owahan kuantitatif ing metabolit khusus bisa diamati ing skala populasi, dene beda kualitatif sing kuwat biasane dijaga ing tingkat spesies (20). Mulane, keragaman metabolisme tanduran minangka aspek utama saka keragaman fungsional, sing nggambarake kemampuan adaptasi menyang relung sing beda, utamane relung kasebut kanthi kemungkinan invasi sing beda dening serangga khusus lan herbivora umum (21). Wiwit artikel Fraenkel (22) sing inovatif babagan alesan anane metabolit spesifik tanduran, interaksi karo macem-macem serangga wis dianggep minangka tekanan seleksi sing penting, lan interaksi kasebut diyakini wis mbentuk tanduran sajrone evolusi. Jalur metabolisme (23). Beda antar spesies ing keragaman metabolit khusus uga bisa nggambarake keseimbangan fisiologis sing ana gandhengane karo pertahanan tanduran konstitutif lan bisa diinduksi nglawan strategi herbivora, amarga loro spesies kasebut asring berkorelasi negatif karo siji liyane (24). Sanajan bisa migunani kanggo njaga pertahanan sing apik saben wektu, owah-owahan metabolisme sing pas wektune sing ana gandhengane karo pertahanan menehi keuntungan sing jelas kanggo ngidini tanduran ngalokasikan sumber daya sing terkenal kanggo investasi fisiologis liyane (19, 24), lan ngindhari kebutuhan simbiosis. Karusakan jaminan (25). Kajaba iku, reorganisasi metabolit khusus sing disebabake dening herbivora serangga iki bisa nyebabake distribusi destruktif ing populasi (26), lan bisa uga nggambarake bacaan langsung saka owah-owahan alami sing substansial ing sinyal asam jasmonat (JA), sing bisa dijaga ing populasi. Sinyal JA sing dhuwur lan endhek minangka trade-off antarane pertahanan nglawan herbivora lan kompetisi karo spesies tartamtu (27). Kajaba iku, jalur biosintetik metabolit khusus bakal ngalami kerugian lan transformasi sing cepet sajrone evolusi, sing nyebabake distribusi metabolisme sing ora rata ing antarane spesies sing raket banget (28). Polimorfisme iki bisa digawe kanthi cepet minangka respon kanggo owah-owahan pola herbivora (29), sing tegese fluktuasi komunitas herbivora minangka faktor kunci sing nyebabake heterogenitas metabolisme.
Ing kene, kita khusus ngrampungake masalah ing ngisor iki. (I) Kepiye carane serangga herbivora ngonfigurasi ulang metabolit tanduran? (Ii) Apa komponen informasi utama plastisitas metabolik sing bisa diukur kanggo nguji prediksi teori pertahanan jangka panjang? (Iii) Apa kudu program ulang metabolit tanduran kanthi cara sing unik kanggo penyerang, yen mangkono, apa peran hormon tanduran kanggo nyetel respon metabolik tartamtu, lan metabolit endi sing nyumbang kanggo spesifisitas spesies pertahanan? (Iv) Amarga prediksi sing digawe dening akeh teori pertahanan bisa ditambahi ing kabeh tingkat jaringan biologis, kita takon sepira konsisten respon metabolik sing disebabake saka perbandingan internal nganti perbandingan antar spesies? Kanggo tujuan iki, kita wis nyinaoni kanthi sistematis metabolit godhong nikotin rokok, yaiku tanduran model ekologis kanthi metabolisme khusus sing sugih, lan efektif nglawan larva rong herbivora asli, Lepidoptera Datura (Ms) (Agresif banget, utamane dipangan). Ing Solanaceae lan Spodoptera littoralis (Sl), cacing godhong kapas minangka jinis "genus", kanthi tanduran inang Solanaceae lan inang liyane saka genera lan kulawarga liyane. Panganan tanduran. Kita ngurai spektrum metabolomik MS/MS lan ngekstrak deskriptor statistik teori informasi kanggo mbandhingake teori OD lan MT. Nggawe peta spesifisitas kanggo mbukak identitas metabolit utama. Analisis kasebut ditambahi menyang populasi asli N. nasi lan spesies rokok sing ana gandhengane kanggo nganalisis luwih lanjut kovarian antarane sinyal hormon tanduran lan induksi OD.
Kanggo njupuk peta sakabèhé babagan plastisitas lan struktur metabolit godhong tembakau herbivora, kita nggunakake alur kerja analisis lan pitungan sing wis dikembangake sadurunge kanggo ngumpulake lan misahake spektrum MS/MS independen data resolusi dhuwur saka ekstrak tanduran (9). Metode sing ora dibedakake iki (disebut MS/MS) bisa mbangun spektrum senyawa non-redundan, sing banjur bisa digunakake kanggo kabeh analisis tingkat senyawa sing diterangake ing kene. Metabolit tanduran sing dipisahake iki saka macem-macem jinis, sing kasusun saka atusan nganti ewonan metabolit (udakara 500-1000-s/MS/MS ing kene). Ing kene, kita nimbang plastisitas metabolik ing kerangka teori informasi, lan ngukur keragaman lan profesionalisme metabolit adhedhasar entropi Shannon saka distribusi frekuensi metabolik. Nggunakake rumus sing wis dileksanakake sadurunge (8), kita ngetung sakumpulan indikator sing bisa digunakake kanggo ngukur keragaman metabolit (indikator Hj), spesialisasi profil metabolik (indikator δj) lan spesifisitas metabolik saka metabolit tunggal (indikator Si). Kajaba iku, kita ngetrapake Indeks Plastisitas Jarak Relatif (RDPI) kanggo ngukur induktibilitas metabolit herbivora (Gambar 1A) (30). Ing kerangka statistik iki, kita nganggep spektrum MS/MS minangka unit informasi dhasar, lan ngolah kelimpahan relatif MS/MS dadi peta distribusi frekuensi, banjur nggunakake entropi Shannon kanggo ngira-ira keragaman metabolit saka iku. Spesialisasi metabolit diukur kanthi spesifisitas rata-rata spektrum MS/MS tunggal. Mulane, paningkatan kelimpahan sawetara kelas MS/MS sawise induksi herbivora diowahi dadi induktibilitas spektral, RDPI lan spesialisasi, yaiku, paningkatan indeks δj, amarga metabolit sing luwih khusus diprodhuksi lan indeks Si sing dhuwur diprodhuksi. Penurunan indeks keragaman Hj nuduhake yen jumlah MS/MS sing diasilake suda, utawa distribusi frekuensi profil owah ing arah sing kurang seragam, nalika nyuda ketidakpastian sakabèhé. Liwat pitungan indeks Si, bisa dideleng MS/MS endi sing diinduksi dening herbivora tartamtu, kosok baline, MS/MS endi sing ora nanggapi induksi, sing minangka indikator kunci kanggo mbedakake prediksi MT lan OD.
(A) Deskriptor statistik sing digunakake kanggo induktivitas data MS/MS (RDPI) herbivora (H1 nganti Hx), keragaman (indeks Hj), spesialisasi (indeks δj) lan spesifisitas metabolit (indeks Si). Peningkatan derajat spesialisasi (δj) nuduhake yen, rata-rata, luwih akeh metabolit spesifik herbivora sing bakal diasilake, dene penurunan keragaman (Hj) nuduhake penurunan produksi metabolit utawa distribusi metabolit sing ora rata ing peta distribusi. Nilai Si neliti apa metabolit kasebut spesifik kanggo kondisi tartamtu (ing kene, herbivora) utawa kosok baline dijaga ing tingkat sing padha. (B) Diagram konseptual prediksi teori pertahanan nggunakake sumbu teori informasi. Teori OD prédhiksi yen serangan herbivora bakal nambah metabolit pertahanan, saengga nambah δj. Ing wektu sing padha, Hj mudhun amarga profil kasebut diatur maneh menyang ketidakpastian informasi metabolik sing suda. Teori MT ngira-ira yen serangan herbivora bakal nyebabake owah-owahan non-arah ing metabolit, saengga nambah Hj minangka indikator ketidakpastian informasi metabolik sing tambah lan nyebabake distribusi acak Si. Kita uga ngusulake model campuran, MT paling apik, ing ngendi sawetara metabolit kanthi nilai pertahanan sing luwih dhuwur bakal tambah akeh (nilai Si dhuwur), dene liyane nuduhake respon acak (nilai Si sing luwih murah).
Nggunakake deskriptor teori informasi, kita napsirake teori OD kanggo prédhiksi manawa owah-owahan metabolit khusus sing diinduksi herbivora ing kahanan konstitutif sing ora diinduksi bakal nyebabake (i) paningkatan spesifisitas metabolik (indeks Si) sing ndorong spesifisitas metabonomi (indeks δj). Peningkatan) klompok metabolit khusus tartamtu kanthi nilai pertahanan sing luwih dhuwur, lan (ii) penurunan keragaman metabolit (indeks Hj) amarga owah-owahan distribusi frekuensi metabolik dadi distribusi awak leptin sing luwih akeh. Ing tingkat metabolit tunggal, distribusi Si sing teratur diarepake, ing ngendi metabolit bakal nambah nilai Si miturut nilai pertahanane (Gambar 1B). Ing sadawane iki, kita nerangake teori MT kanggo prédhiksi manawa eksitasi bakal nyebabake (i) owah-owahan non-arah ing metabolit sing nyebabake penurunan indeks δj, lan (ii) peningkatan indeks Hj amarga peningkatan ketidakpastian metabolik. Utawa keacakan, sing bisa diukur dening entropi Shannon ing wangun keragaman umum. Kanggo komposisi metabolik, teori MT bakal prédhiksi distribusi acak Si. Ngelingi manawa metabolit tartamtu ana ing kahanan tartamtu ing kahanan tartamtu, lan kahanan liyane ora ana ing kahanan tartamtu, lan nilai pertahanane gumantung marang lingkungan, kita uga ngusulake model pertahanan campuran, ing ngendi δj lan Hj disebar ing loro sadawane Si. Peningkatan ing kabeh arah, mung klompok metabolit tartamtu, sing duwe nilai pertahanan sing luwih dhuwur, sing bakal nambah Si, dene liyane bakal duwe distribusi acak (Gambar 1B).
Kanggo nguji prediksi teori pertahanan sing wis didefinisi ulang ing sumbu deskriptor teori informasi, kita ngunggahake larva herbivora ahli (Ms) utawa generalis (Sl) ing godhong Nepenthes pallens (Gambar 2A). Nggunakake analisis MS/MS, kita njupuk 599 spektrum MS/MS non-redundan (file data S1) saka ekstrak metanol jaringan godhong sing dikumpulake sawise mangan ulat. Nggunakake indeks RDPI, Hj, lan δj kanggo nggambarake konfigurasi ulang konten informasi ing file konfigurasi MS/MS nuduhake pola sing menarik (Gambar 2B). Tren sakabèhé yaiku, kaya sing diterangake dening deskriptor informasi, nalika ulat terus mangan godhong, tingkat kabeh reorganisasi metabolik mundhak suwe-suwe: 72 jam sawise herbivora mangan, RDPI mundhak sacara signifikan. Dibandhingake karo kontrol sing ora rusak, Hj mudhun sacara signifikan, sing disebabake dening tambahing tingkat spesialisasi profil metabolik, sing diukur nganggo indeks δj. Tren sing katon iki konsisten karo prediksi teori OD, nanging ora konsisten karo prediksi utama teori MT, sing percaya yen owah-owahan acak (non-arah) ing tingkat metabolit digunakake minangka kamuflase pertahanan (Gambar 1B). Sanajan isi elisitor sekresi oral (OS) lan prilaku mangan saka rong herbivora iki beda, panganan langsung nyebabake owah-owahan sing padha ing arah Hj lan δj sajrone periode panen 24 jam lan 72 jam. Bedane mung kedadeyan ing 72 jam RDPI. Dibandhingake karo sing disebabake dening panganan Ms, metabolisme sakabèhé sing disebabake dening panganan Sl luwih dhuwur.
(A) Desain eksperimen: herbivora babi biasa (S1) utawa ahli (Ms) diwenehi panganan godhong desalinasi saka tanduran kantong semar, dene kanggo herbivora simulasi, OS Ms (W + OSM) digunakake kanggo nangani tusukan posisi godhong standar sing tatu. Larva S1 (W + OSSl) utawa banyu (W + W). Kontrol (C) yaiku godhong sing ora rusak. (B) Inducibility (RDPI dibandhingake karo grafik kontrol), keragaman (indeks Hj) lan indeks spesialisasi (indeks δj) sing diitung kanggo peta metabolit khusus (599 MS/MS; file data S1). Tanda bintang nuduhake beda sing signifikan antarane panganan herbivora langsung lan klompok kontrol (uji-t Student karo uji-t pasangan, *P<0,05 lan ***P<0,001). ns, ora penting. (C) Indeks resolusi wektu saka spektrum metabolit utama (kothak biru, asam amino, asam organik lan gula; file data S2) lan spektrum metabolit khusus (kothak abang 443 MS/MS; file data S1) sawise simulasi perawatan herbivora. Pita warna nuduhake interval kapercayan 95%. Asterisk nuduhake bedane sing signifikan antarane perawatan lan kontrol [analisis varians kuadrat (ANOVA), diikuti dening bedane sing signifikan sacara jujur ​​​​Tukey (HSD) kanggo perbandingan ganda post hoc, *P<0,05, **P<0,01 Lan *** P <0,001]. (D) Spesialisasi plot sebar lan profil metabolit khusus (sampel bola-bali kanthi perawatan sing beda).
Kanggo njelajah apa remodeling sing diinduksi herbivora ing tingkat metabolit katon ing owah-owahan ing tingkat metabolit individu, kita pisanan fokus ing metabolit sing wis ditliti sadurunge ing godhong Nepenthes pallens kanthi resistensi herbivora sing wis kabukten. Amida fenolik yaiku konjugat hidroksisinamamide-poliamina sing nglumpuk sajrone proses herbivora serangga lan dikenal bisa nyuda kinerja serangga (32). Kita nggoleki prekursor MS/MS sing cocog lan nggambar kurva kinetik kumulatif (Gambar S1). Ora nggumunake, turunan fenol sing ora langsung melu pertahanan nglawan herbivora, kayata asam klorogenik (CGA) lan rutin, mudhun sawise herbivora. Kosok baline, herbivora bisa nggawe fenol amida dadi kuat banget. Panganan terus-terusan saka rong herbivora nyebabake spektrum eksitasi fenolamida sing meh padha, lan pola iki utamane jelas kanggo sintesis fenolamida de novo. Fenomena sing padha bakal diamati nalika njelajah jalur 17-hydroxygeranyl nonanediol diterpene glycosides (17-HGL-DTGs), sing ngasilake akeh diterpen asiklik kanthi fungsi anti-herbivora sing efektif (33), sing Ms Feeding karo Sl micu profil ekspresi sing padha (Gambar S1)).
Kekurangan sing bisa kedadeyan saka eksperimen pakan herbivora langsung yaiku bedane tingkat konsumsi godhong lan wektu pakan herbivora, sing ndadekake angel ngilangi efek spesifik herbivora sing disebabake dening tatu lan herbivora. Kanggo ngatasi spesifisitas spesies herbivora saka respon metabolisme godhong sing diinduksi kanthi luwih apik, kita simulasi pakan larva Ms lan Sl kanthi langsung ngetrapake OS sing nembe dikumpulake (OSM lan OSS1) menyang tusukan standar W kanthi posisi godhong sing konsisten. Prosedur iki diarani perawatan W + OS, lan standarisasi induksi kanthi tepat wektu wiwitan respon sing ditimbulake dening herbivora tanpa nyebabake efek sing ngganggu saka bedane tingkat utawa jumlah mundhut jaringan (Gambar 2A) (34). Nggunakake analisis MS/MS lan pipa pitungan, kita njupuk 443 spektrum MS/MS (file data S1), sing tumpang tindih karo spektrum sing wis dirakit sadurunge saka eksperimen pakan langsung. Analisis teori informasi saka set data MS/MS iki nuduhake yen pemrograman ulang metabolit khusus godhong kanthi simulasi herbivora nuduhake induksi spesifik OS (Gambar 2C). Utamane, dibandhingake karo perawatan OSS1, OSM nyebabake peningkatan spesialisasi metabolit sajrone 4 jam. Perlu dicathet yen dibandhingake karo set data eksperimen sing menehi panganan herbivora langsung, kinetika metabolik sing divisualisasikake ing ruang rong dimensi nggunakake Hj lan δj minangka koordinat lan arah spesialisasi metabolit minangka respon kanggo perawatan herbivora simulasi kanthi bertahap Tambah konsisten (Gambar 2D). Ing wektu sing padha, kita ngetung isi asam amino, asam organik, lan gula (file data S2) kanggo nyelidiki apa peningkatan keahlian metabolit sing ditargetkan iki amarga konfigurasi ulang metabolisme karbon pusat minangka respon kanggo herbivora simulasi (Gambar S2). Kanggo nerangake pola iki kanthi luwih apik, kita luwih ngawasi kinetika akumulasi metabolik saka jalur fenolamida lan 17-HGL-DTG sing wis dibahas sadurunge. Induksi herbivora khusus OS diowahi dadi pola penyusunan ulang diferensial ing metabolisme fenolamida (Gambar S3). Amida fenolik sing ngandhut gugus kumarin lan kafein luwih disenengi diinduksi dening OSS1, dene OSM micu induksi spesifik konjugat ferulil. Kanggo jalur 17-HGL-DTG, induksi OS diferensial dening produk malonilasi lan dimalonilasi hilir dideteksi (Gambar S3).
Sabanjure, kita nyinaoni plastisitas transkriptom sing diinduksi OS nggunakake set data microarray wektu-kursus, sing nyimulasikake panggunaan OSM kanggo nambani godhong godhong tanduran roset ing herbivora. Kinetika sampling umume tumpang tindih karo kinetika sing digunakake ing panliten metabolomik iki (35). Dibandhingake karo konfigurasi ulang metabolome ing ngendi plastisitas metabolik saya tambah suwe, kita mirsani semburan transkripsi sementara ing godhong sing diinduksi dening Ms, ing ngendi induktibilitas transkriptom (RDPI) lan spesialisasi (δj) ana ing 1. Ana peningkatan sing signifikan ing jam, lan keragaman (Hj) ing wektu iki, ekspresi BMP1 suda sacara signifikan, diikuti karo relaksasi spesialisasi transkriptom (Gambar S4). Kulawarga gen metabolik (kayata P450, glikosiltransferase, lan BAHD asiltransferase) melu proses nglumpukake metabolit khusus saka unit struktural sing asale saka metabolisme primer, ngetutake model spesialisasi dhuwur awal sing kasebut ing ndhuwur. Minangka studi kasus, jalur fenilalanin dianalisis. Analisis kasebut ngonfirmasi manawa gen inti ing metabolisme fenolamida diinduksi OS banget ing herbivora dibandhingake karo tanduran sing ora kepincut, lan pola ekspresine raket banget. Faktor transkripsi MYB8 lan gen struktural PAL1, PAL2, C4H lan 4CL ing hulu jalur iki nuduhake inisiasi transkripsi awal. Asiltransferase sing nduweni peran ing perakitan pungkasan fenolamida, kayata AT1, DH29, lan CV86, nuduhake pola upregulasi sing berkepanjangan (Gambar S4). Pengamatan ing ndhuwur nuduhake manawa inisiasi awal spesialisasi transkriptom lan peningkatan spesialisasi metabolomik sing luwih anyar minangka mode gandhengan, sing bisa uga amarga sistem pengaturan sinkron sing miwiti respon pertahanan sing kuat.
Konfigurasi ulang ing sinyal hormon tanduran tumindak minangka lapisan pangaturan sing nggabungake informasi herbivora kanggo mrogram ulang fisiologi tanduran. Sawise simulasi herbivora, kita ngukur dinamika kumulatif kategori hormon tanduran utama lan nggambarake ko-ekspresi temporal ing antarane [koefisien korelasi Pearson (PCC)> 0.4] (Gambar 3A). Kaya sing dikarepake, hormon tanduran sing ana gandhengane karo biosintesis digandhengake ing jaringan ko-ekspresi hormon tanduran. Kajaba iku, spesifisitas metabolik (indeks Si) dipetakan menyang jaringan iki kanggo nyorot hormon tanduran sing diinduksi dening perawatan sing beda. Rong area utama respon spesifik herbivora digambar: siji ana ing kluster JA, ing ngendi JA (bentuk aktif biologis JA-Ile) lan turunan JA liyane nuduhake skor Si paling dhuwur; liyane yaiku etilena (ET). Giberelin mung nuduhake peningkatan moderat ing spesifisitas herbivora, dene hormon tanduran liyane, kayata sitokinin, auksin, lan asam absisat, duwe spesifisitas induksi sing kurang kanggo herbivora. Dibandhingake karo nggunakake W + W wae, amplifikasi nilai puncak turunan JA liwat aplikasi OS (W + OS) bisa diowahi dadi indikator spesifik sing kuwat saka JA. Tanpa diduga, OSM lan OSS1 kanthi isi elisitor sing beda dikenal nyebabake akumulasi JA lan JA-Ile sing padha. Beda karo OSS1, OSM diinduksi kanthi khusus lan kuwat dening OSM, dene OSS1 ora nguatake respon tatu basal (Gambar 3B).
(A) Analisis jaringan ko-ekspresi adhedhasar pitungan PCC saka simulasi kinetika akumulasi hormon tanduran sing diinduksi herbivora. Node kasebut makili hormon tanduran tunggal, lan ukuran node makili indeks Si khusus kanggo hormon tanduran antarane perawatan. (B) Akumulasi JA, JA-Ile lan ET ing godhong sing disebabake dening perawatan sing beda-beda sing dituduhake dening warna sing beda-beda: aprikot, W + OSM; biru, W + OSSl; ireng, W + W; abu-abu, C (kontrol). Asterisk nuduhake beda sing signifikan antarane perawatan lan kontrol (ANOVA rong arah diikuti dening Tukey HSD post hoc multiple comparison, *** P <0,001). Analisis teori informasi (C)697 MS/MS (file data S1) ing biosintesis JA lan spektrum persepsi sing cacat (irAOC lan irCOI1) lan (D)585 MS/MS (file data S1) ing ETR1 kanthi sinyal ET sing cacat Rong perawatan herbivora simulasi micu garis tanduran lan pabrik kontrol kendaraan kosong (EV). Tandha asterisk nuduhake bedane sing signifikan antarane perawatan W+OS lan kontrol sing ora rusak (ANOVA rong arah diikuti dening Tukey HSD post hoc multiple comparison, *P<0,05, **P<0,01 lan ***P<0,001). (E) Grafik sing kasebar saka oposisi sing kasebar kanggo spesialisasi. Werna-werna kasebut makili galur sing dimodifikasi sacara genetis sing beda; simbol-simbol kasebut makili cara perawatan sing beda: segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; bunder C
Sabanjure, kita nggunakake galur Nepenthes sing dilemahake (irCOI1 lan sETR1) sing dimodifikasi sacara genetis ing langkah-langkah kunci biosintesis JA lan ET (irAOC lan irACO) lan persepsi (irCOI1 lan sETR1) kanggo nganalisis metabolisme rong hormon tanduran iki ing herbivora. Kontribusi relatif saka pemrograman ulang. Konsisten karo eksperimen sadurunge, kita ngonfirmasi induksi herbivora-OS ing tanduran pembawa kosong (EV) (Gambar 3, C nganti D) lan penurunan sakabèhé ing indeks Hj sing disebabake dening OSM, dene indeks δj mundhak. Respon luwih jelas tinimbang respon sing dipicu dening OSS1. Grafik rong baris nggunakake Hj lan δj minangka koordinat nuduhake deregulasi spesifik (Gambar 3E). Tren sing paling jelas yaiku ing galur sing ora duwe sinyal JA, keragaman metabolit lan owah-owahan spesialisasi sing disebabake dening herbivora meh kabeh diilangi (Gambar 3C). Kosok baline, persepsi ET sing meneng ing tanduran sETR1, sanajan efek sakabèhé marang owah-owahan metabolisme herbivora luwih murah tinimbang sinyal JA, ngurangi prabédan ing indeks Hj lan δj antarane eksitasi OSM lan OSS1 (Gambar 3D lan Gambar S5). Iki nuduhake yen saliyane fungsi inti transduksi sinyal JA, transduksi sinyal ET uga dadi panyesuaian respon metabolisme spesifik spesies herbivora. Konsisten karo fungsi panyesuaian iki, ora ana owah-owahan ing indukbilitas metabolit sakabèhé ing tanduran sETR1. Ing sisih liya, dibandhingake karo tanduran sETR1, tanduran irACO nyebabake amplitudo sakabèhé sing padha saka owah-owahan metabolisme sing disebabake dening herbivora, nanging nuduhake skor Hj lan δj sing beda banget antarane tantangan OSM lan OSS1 (Gambar S5).
Kanggo ngenali metabolit khusus sing nduweni kontribusi penting kanggo respon spesifik spesies herbivora lan nyetel produksine liwat sinyal ET, kita nggunakake metode MS/MS struktural sing wis dikembangake sadurunge. Metode iki gumantung marang metode bi-clustering kanggo nyimpulake maneh kulawarga metabolik saka fragmen MS/MS [produk titik normal (NDP)] lan skor similaritas adhedhasar kerugian netral (NL). Set data MS/MS sing dibangun liwat analisis garis transgenik ET ngasilake 585 MS/MS (file data S1), sing dirampungake kanthi nglompokake dadi pitung modul MS/MS utama (M) (Gambar 4A). Sawetara modul kasebut dikemas kanthi metabolit khusus sing wis dikarakterisasi sadurunge: contone, M1, M2, M3, M4 lan M7 sugih ing macem-macem turunan fenol (M1), glikosida flavonoid (M2), gula asil (M3 Lan M4), lan 17-HGL-DTG (M7). Kajaba iku, informasi spesifik metabolik (indeks Si) saka metabolit tunggal ing saben modul diitung, lan distribusi Si bisa dideleng kanthi intuitif. Cekakipun, spektrum MS/MS sing nuduhake herbivora lan spesifisitas genotipe sing dhuwur ditondoi kanthi nilai Si sing dhuwur, lan statistik kurtosis nuduhake distribusi wulu ing pojok buntut tengen. Salah sawijining distribusi koloid ramping kasebut dideteksi ing M1, ing ngendi fenol amida nuduhake fraksi Si paling dhuwur (Gambar 4B). 17-HGL-DTG sing bisa diinduksi herbivora sing kasebut sadurunge ing M7 nuduhake skor Si moderat, sing nuduhake tingkat regulasi diferensial moderat antarane rong jinis OS. Kosok baline, umume metabolit khusus sing diasilake kanthi konstitutif, kayata rutin, CGA, lan gula asil, kalebu skor Si paling endhek. Kanggo njelajah kompleksitas struktural lan distribusi Si antarane metabolit khusus, jaringan molekuler dibangun kanggo saben modul (Gambar 4B). Prediksi penting saka teori OD (sing dirangkum ing Gambar 1B) yaiku reorganisasi metabolit khusus sawise herbivora kudu nyebabake owah-owahan siji arah ing metabolit kanthi nilai pertahanan sing dhuwur, utamane kanthi nambah spesifisitas (beda karo distribusi acak) Mode) Metabolit pertahanan sing diprediksi dening teori MT. Umume turunan fenol sing diklumpukake ing M1 ana hubungane karo penurunan kinerja serangga (32). Nalika mbandhingake nilai Si ing metabolit M1 antarane godhong sing diinduksi lan godhong konstituen saka tanduran kontrol EV sajrone 24 jam, kita mirsani manawa spesifisitas metabolik akeh metabolit sawise serangga herbivora duwe tren peningkatan sing signifikan (Gambar 4C). Peningkatan spesifik ing nilai Si mung dideteksi ing fenolamida pertahanan, nanging ora ana peningkatan nilai Si sing dideteksi ing fenol liyane lan metabolit sing ora dingerteni sing ana ing modul iki. Iki minangka model khusus, sing ana hubungane karo teori OD. Prediksi utama babagan owah-owahan metabolisme sing disebabake dening herbivora konsisten. Kanggo nguji apa kekhasan spektrum fenolamida iki diinduksi dening ET spesifik OS, kita nggambar indeks metabolit Si lan nyebabake nilai ekspresi diferensial antarane OSM lan OSS1 ing genotipe EV lan sETR1 (Gambar 4D). Ing sETR1, bedane sing diinduksi fenamida antarane OSM lan OSS1 saya suda. Metode bi-clustering uga diterapake ing data MS/MS sing diklumpukake ing galur kanthi JA sing ora cukup kanggo nyimpulake modul MS/MS utama sing ana gandhengane karo spesialisasi metabolik sing diatur JA (Gambar S6).
(A) Asil klasterisasi 585 MS/MS adhedhasar fragmen sing dienggo bareng (kemiripan NDP) lan kerugian netral sing dienggo bareng (kemiripan NL) nyebabake modul (M) konsisten karo kulawarga senyawa sing dikenal, utawa kanthi komposisi Metabolit sing ora dingerteni utawa ora dimetabolisme kanthi apik. Ing jejere saben modul, distribusi spesifik metabolit (MS/MS) (Si) dituduhake. (B) Jaringan molekuler modular: Node makili MS/MS lan pinggiran, skor MS/MS NDP (abang) lan NL (biru) (cut-off, > 0,6). Indeks spesifisitas metabolit sing dinilai (Si) diwarnai adhedhasar modul (kiwa) lan dipetakan menyang jaringan molekuler (tengen). (C) Modul M1 saka tanduran EV ing kahanan konstitutif (kontrol) lan diinduksi (herbivora simulasi) ing 24 jam: diagram jaringan molekuler (nilai Si minangka ukuran node, fenolamida defensif disorot nganggo warna biru). (D) Diagram jaringan molekuler M1 saka garis spektrum sETR1 kanthi persepsi EV lan ET sing kurang apik: senyawa fenolik sing diwakili dening simpul bunder ijo, lan bedane sing signifikan (nilai P) antarane perawatan W + OSM lan W + OSS1 minangka ukuran Simpul. CP, N-caffeoyl-tirosin; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, asam N-ferulic asam ester-urat; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tirosin; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum ing wolfberry Son; Nick. O-AS, gula O-asil.
Kita luwih ngembangake analisis saka siji genotipe Nepenthes sing dilemahake menyang populasi alami, ing ngendi owah-owahan intraspesifik sing kuwat ing tingkat JA herbivora lan tingkat metabolit spesifik wis diterangake sadurunge ing populasi alami (26). Gunakake set data iki kanggo nutupi 43 plasma nutfah. Plasma nutfah iki kasusun saka 123 spesies tanduran saka N. pallens. Tanduran iki dijupuk saka wiji sing dikumpulake ing habitat asli sing beda ing Utah, Nevada, Arizona, lan California (Gambar S7), kita ngetung keragaman metabolit (ing kene diarani tingkat populasi) keragaman β) lan spesialisasi sing disebabake dening OSM. Konsisten karo panliten sadurunge, kita mirsani macem-macem owah-owahan metabolik ing sadawane sumbu Hj lan δj, sing nuduhake yen plasma nutfah duwe bedane sing signifikan ing plastisitas respon metabolik marang herbivora (Gambar S7). Organisasi iki ngelingake pengamatan sadurunge babagan rentang dinamis owah-owahan JA sing disebabake dening herbivora, lan wis njaga nilai sing dhuwur banget ing populasi tunggal (26, 36). Kanthi nggunakake JA lan JA-Ile kanggo nguji korelasi tingkat sakabèhé antarane Hj lan δj, kita nemokake manawa ana korelasi positif sing signifikan antarane JA lan indeks keragaman lan spesialisasi metabolit β (Gambar S7). Iki nuduhake manawa heterogenitas sing diinduksi herbivora ing induksi JA sing dideteksi ing tingkat populasi bisa uga amarga polimorfisme metabolik utama sing disebabake dening seleksi saka herbivora serangga.
Panliten sadurunge nuduhake yen jinis rokok beda-beda banget ing jinis lan katergantungan relatif marang pertahanan metabolik sing diinduksi lan konstitutif. Dipercaya manawa owah-owahan ing transduksi sinyal anti-herbivora lan kemampuan pertahanan diatur dening tekanan populasi serangga, siklus urip tanduran, lan biaya produksi pertahanan ing niche ing ngendi spesies tartamtu tuwuh. Kita nyinaoni konsistensi remodeling metabolit godhong sing diinduksi dening herbivora saka enem spesies Nicotiana sing asli saka Amerika Utara lan Amerika Selatan. Spesies kasebut raket banget karo Nepenthes Amerika Utara, yaiku Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. suket sing dilemahake, Nicotiana tabacum, tembakau linier, tembakau (Nicotiana spegazzinii) lan tembakau godhong tembakau (Nicotiana obtusifolia) (Gambar 5A) (37). Enem spesies kasebut, kalebu spesies N. sing wis ditondoi kanthi apik, minangka tanduran taunan saka clade petunia, lan obtusifolia N. minangka tanduran taunan saka clade adhine Trigonophyllae (38). Sabanjure, induksi W + W, W + OSM lan W + OSS1 ditindakake ing pitung spesies iki kanggo nyinaoni penyusunan ulang metabolisme tingkat spesies saka panganan serangga.
(A) Wit filogenetik bootstrap adhedhasar kemungkinan maksimum [kanggo sintesis glutamin nuklir (38)] lan distribusi geografis saka pitung spesies Nicotiana sing raket banget (werna sing beda) (37). (B) Plot sebar keragaman khusus kanggo profil metabolik saka pitung spesies Nicotiana (939 MS/MS; file data S1). Ing tingkat spesies, keragaman metabolit berkorelasi negatif karo tingkat spesialisasi. Analisis korelasi tingkat spesies antarane keragaman metabolik lan spesialisasi lan akumulasi JA dituduhake ing Gambar 2. S9. Werna, jinis sing beda; segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; (C) Dinamika Nicotiana JA lan JA-Ile diurut miturut amplitudo eksitasi OS (ANOVA rong arah lan Tukey HSD pasca-perbandingan kaping pirang-pirang, * P <0,05, ** P <0,01 lan * ** Kanggo perbandingan W + OS lan W + W, P <0,001). Plot kothak (D) keragaman lan (E) spesialisasi saben spesies sawise simulasi herbivora lan metil JA (MeJA). Tandha asterisk nuduhake bedane sing signifikan antarane W + OS lan W + W utawa lanolin ditambah W (Lan + W) utawa Lan ditambah MeJA (Lan + MeJa) lan kontrol Lan (analisis varians rong arah, diterusake karo perbandingan ganda post hoc HSD Tukey, *P<0,05, **P<0,01 lan ***P<0,001).
Nggunakake metode dual cluster, kita ngidentifikasi 9 modul saka 939 MS/MS (file data S1). Komposisi MS/MS sing dikonfigurasi ulang dening perawatan sing beda-beda beda-beda banget ing antarane modul sing beda-beda antarane spesies (Gambar S8). Visualisasi Hj (sing diarani ing kene minangka keragaman γ tingkat spesies) lan δj nuduhake manawa spesies sing beda-beda nglumpuk dadi klompok sing beda banget ing ruang metabolisme, ing ngendi divisi tingkat spesies biasane luwih jelas tinimbang eksitasi. Kajaba N. linear lan N. obliquus, dheweke nuduhake macem-macem efek induksi dinamis (Gambar 5B). Kosok baline, spesies kayata N. purpurea lan N. obtusifolia duwe respon metabolik sing kurang jelas kanggo perawatan, nanging metabolite luwih maneka warna. Distribusi spesifik spesies saka respon metabolik sing diinduksi nyebabake korelasi negatif sing signifikan antarane spesialisasi lan keragaman gamma (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). Owah-owahan tingkat JA sing diinduksi OS berkorelasi positif karo spesialisasi metabolom, lan berkorelasi negatif karo keragaman gamma metabolik sing ditampilake dening saben spesies (Gambar 5B lan Gambar S9). Perlu dicathet yen spesies sing diarani spesies "respon sinyal" ing Gambar 5C, kayata Nepenthes nematoda, Nepenthes nepenthes, Nepenthes akut, lan Nepenthes dilemahkan, nyebabake tandha-tandha sing signifikan ing 30 menit. Wabah JA lan JA-Ile spesifik OS anyar, dene bakteri liyane sing diarani "sinyal ora responsif", kayata Nepenthes mills, Nepenthes powdery lan N. obtusifolia mung nuduhake induksi JA-Ile Edge tanpa spesifisitas OS (Gambar 5C). Ing tingkat metabolisme, kaya sing kasebut ing ndhuwur, kanggo Nepenthes sing dilemahkan, zat responsif sinyal nuduhake spesifisitas OS lan nambah δj kanthi signifikan, nalika nyuda Hj. Efek priming spesifik OS iki ora dideteksi ing spesies sing diklasifikasikake minangka spesies sinyal non-reaktif (Gambar 5, D lan E). Metabolit spesifik OS luwih kerep dienggo bareng antarane spesies sing responsif sinyal, lan kluster sinyal iki kluster karo spesies kanthi respon sinyal sing luwih lemah, dene spesies kanthi respon sinyal sing luwih lemah nuduhake saling ketergantungan sing luwih sithik (Gambar S8). Asil iki nuduhake yen induksi JA spesifik OS lan konfigurasi ulang spesifik OS saka metabolit hilir digandhengake ing tingkat spesies.
Sabanjure, kita nggunakake pasta lanolin sing ngandhut metil JA (MeJA) kanggo nambani tanduran kanggo nyelidiki apa mode kopling iki diwatesi dening kasedhiyan JA sing ditrapake dening JA eksogen, sing bakal ana ing sitoplasma tanduran. Deesterifikasi cepet yaiku JA. Kita nemokake tren sing padha babagan owah-owahan bertahap saka spesies sing responsif sinyal menyang spesies sing ora responsif sinyal sing disebabake dening pasokan JA sing terus-terusan (Gambar 5, D lan E). Cekakipun, perawatan MeJA kanthi kuat ngrogram ulang metabolit nematoda linier, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, lan N. mikimotoi, sing nyebabake peningkatan δj sing signifikan lan penurunan Hj. N. purpurea mung nuduhake peningkatan δj, nanging ora Hj. N. obtusifolia, sing sadurunge wis dituduhake nglumpukake tingkat JA sing sithik banget, uga nanggapi perawatan MeJA kanthi kurang apik babagan konfigurasi ulang metabolom. Asil kasebut nuduhake yen produksi JA utawa transduksi sinyal diwatesi sacara fisiologis ing spesies sing ora responsif sinyal. Kanggo nguji hipotesis iki, kita nyinaoni papat spesies (N. pallens, N. mills, N. pink lan N. microphylla) sing diinduksi dening W + W, W + OSM lan W + OSS1 Transcriptome (39). Konsisten karo pola remodeling metabolit, spesies kasebut dipisahake kanthi apik ing ruang transkriptom, ing antarane N. sing dilemahake nuduhake RDPI sing diinduksi OS paling dhuwur, dene N. gracilis duwe sing paling endhek (Gambar 6A). Nanging, ditemokake yen keragaman transkriptom sing diinduksi dening N. oblonga minangka sing paling endhek ing antarane papat spesies kasebut, beda karo keragaman metabonomi paling dhuwur saka N. oblonga sing sadurunge dituduhake ing pitung spesies. Panliten sadurunge nuduhake yen sakumpulan gen sing ana gandhengane karo sinyal pertahanan awal, kalebu sinyal JA, nerangake spesifisitas respon pertahanan awal sing diinduksi dening elisitor sing ana gandhengane karo herbivora ing spesies Nicotiana (39). Mbandhingake jalur sinyal JA antarane papat spesies iki nuduhake pola sing menarik (Gambar 6B). Umume gen ing jalur iki, kayata AOC, OPR3, ACX lan COI1, nuduhake tingkat induksi sing relatif dhuwur ing papat spesies iki. Nanging, gen kunci, JAR4, ngowahi JA dadi bentuk transkrip akumulasi JA-Ile sing aktif sacara biologis, lan tingkat transkripsi kasebut sithik banget, utamane ing N. mills, Nepenthes pieris lan N. microphylla. Kajaba iku, mung transkrip gen liyane AOS sing ora dideteksi ing N. bifidum. Owah-owahan ing ekspresi gen iki bisa uga dadi tanggung jawab kanggo fenotipe ekstrem sing disebabake dening produksi JA sing sithik ing spesies anergik sinyal lan induksi N. gracilis.
(A) Analisis teori informasi babagan pemrograman ulang respon transkripsi awal saka papat spesies tembakau sing raket banget sing disampel 30 menit sawise induksi herbivora. RDPI diitung kanthi mbandhingake godhong sing diinduksi dening OS herbivora karo kontrol tatu. Werna nuduhake spesies sing beda, lan simbol nuduhake metode perawatan sing beda. (B) Analisis ekspresi gen ing jalur sinyal JA ing antarane papat spesies. Jalur JA sing disederhanakake dituduhake ing jejere plot kothak. Werna sing beda nuduhake metode pangolahan sing beda. Tanda bintang nuduhake yen ana bedane sing signifikan antarane perawatan W + OS lan kontrol W + W (kanggo uji-t Student kanggo bedane pasangan, *P<0,05, **P<0,01 lan ***P<0,001). OPDA, asam 12-oksofitodienoat; OPC-8: asam 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenyl)-siklopentana-1-oktanoat.
Ing bagean pungkasan, kita nyinaoni kepiye remodeling spesifik spesies serangga saka metabolit saka spesies tanduran sing beda-beda bisa tahan marang herbivora. Riset sadurunge nandheske genus Nicotiana. Resistensi marang Ms lan larva beda banget (40). Ing kene, kita nyinaoni hubungan antarane model iki lan plastisitas metabolik. Nggunakake papat spesies tembakau ing ndhuwur, lan nguji korelasi antarane keragaman lan spesialisasi metabolit sing disebabake dening herbivora lan resistensi tanduran marang Ms lan Sl, kita nemokake resistensi, keragaman lan spesialisasi marang Sl All generalis berkorelasi positif, dene korelasi antarane resistensi marang wanita ahli lan spesialisasi lemah, lan korelasi karo keragaman ora signifikan (Gambar S10). Babagan resistensi S1, loro-lorone N. chinensis lan N. gracilis sing dilemahake, sing sadurunge dituduhake nuduhake tingkat transduksi sinyal JA lan plastisitas metabolom, duwe respon sing beda banget marang induksi herbivora, lan uga nuduhake resistensi sing padha. Jenis kelamin.
Sajrone sewidak taun kepungkur, teori pertahanan tanduran wis nyedhiyakake kerangka teoretis, sing adhedhasar para peneliti wis prédhiksi sawetara évolusi lan fungsi metabolit khusus tanduran. Umume teori kasebut ora ngetutake prosedur normal inferensi sing kuwat (41). Dheweke ngusulake prediksi kunci (3) ing tingkat analisis sing padha. Nalika pengujian prediksi kunci ngidini teori tartamtu dianalisis, iki bakal nggawe lapangan iki maju. Didukung, nanging nolak liyane (42). Nanging, teori anyar nggawe prediksi ing tingkat analisis sing beda lan nambah lapisan pertimbangan deskriptif anyar (42). Nanging, rong teori sing diusulake ing tingkat fungsional, MT lan OD, bisa diterangake kanthi gampang minangka prediksi penting babagan owah-owahan metabolisme khusus sing disebabake dening herbivora: Teori OD percaya manawa owah-owahan ing "ruang" metabolik khusus banget arah. Teori MT percaya manawa owah-owahan kasebut bakal ora arah lan dumunung kanthi acak ing ruang metabolisme, lan cenderung duwe metabolit nilai pertahanan sing dhuwur. Pamriksaan sadurunge babagan prediksi OD lan MT wis diuji nggunakake sakumpulan senyawa "pertahanan" a priori sing sempit. Tes sing fokus ing metabolit iki nyegah kemampuan kanggo nganalisis ombone lan lintasan konfigurasi ulang metabolit sajrone herbivora, lan ora ngidini pengujian ing kerangka statistik sing konsisten mbutuhake prediksi kunci sing bisa dianggep minangka sakabèhé. Ngukur owah-owahan ing metabolit tanduran. Ing kene, kita nggunakake teknologi inovatif ing metabolomik adhedhasar MS komputasi lan nindakake analisis MS dekonvolusi ing mata uang umum deskriptor teori informasi kanggo nguji bedane antarane loro sing diusulake ing tingkat metabolomik global. Prediksi kunci teori iki. Teori informasi wis diterapake ing pirang-pirang bidang, utamane ing konteks riset keanekaragaman hayati lan aliran nutrisi (43). Nanging, sak sejauh sing kita ngerti, iki minangka aplikasi pertama sing digunakake kanggo njlèntrèhaké ruang informasi metabolik tanduran lan ngatasi masalah ekologis sing ana gandhengane karo owah-owahan metabolik sementara minangka respon kanggo isyarat lingkungan. Utamane, kemampuan metode iki dumunung ing kemampuane kanggo mbandhingake pola ing njero lan antarane spesies tanduran kanggo mriksa kepiye herbivora wis berkembang saka spesies sing beda menyang pola makroevolusi antar spesies ing tingkat evolusi sing beda. Metabolisme.
Analisis komponen utama (PCA) ngowahi set data multivariat dadi ruang reduksi dimensionalitas supaya tren utama data bisa diterangake, mula biasane digunakake minangka teknik eksplorasi kanggo ngurai set data, kayata metabolome dekonvolusi. Nanging, reduksi dimensionalitas bakal kelangan sebagian isi informasi ing set data, lan PCA ora bisa menehi informasi kuantitatif babagan karakteristik sing relevan banget karo teori ekologi, kayata: kepiye herbivora ngonfigurasi ulang keragaman ing bidang khusus (contone, kekayaan, distribusi) Lan kelimpahan) metabolit? Metabolit endi sing dadi prediktor saka kahanan sing diinduksi saka herbivora tartamtu? Saka perspektif spesifisitas, keragaman lan indukbilitas, isi informasi profil metabolit spesifik godhong diurai, lan ditemokake yen mangan herbivora bisa ngaktifake metabolisme tartamtu. Tanpa diduga, kita mirsani manawa, kaya sing diterangake ing indikator teori informasi sing dileksanakake, kahanan metabolisme sing diasilake duwe tumpang tindih gedhe sawise serangan saka rong herbivora (generalis sing mangan wengi Sl) lan ahli Solanaceae Ms. Sanajan prilaku lan konsentrasi mangan beda banget. Inisiator konjugat asam lemak-asam amino (FAC) ing OS (31). Kanthi nggunakake OS herbivora kanggo nambani tatu tusukan standar, perawatan herbivora simulasi uga nuduhake tren sing padha. Prosedur standar iki kanggo simulasi respon tanduran marang serangan herbivora ngilangi faktor pengganggu sing disebabake dening owah-owahan prilaku mangan herbivora, sing nyebabake macem-macem tingkat kerusakan ing wektu sing beda-beda (34). FAC, sing dikenal minangka panyebab utama OSM, nyuda JAS lan respon hormon tanduran liyane ing OSS1, dene OSS1 nyuda atusan kali (31). Nanging, OSS1 nyebabake tingkat akumulasi JA sing padha dibandhingake karo OSM. Sadurunge wis dituduhake manawa respon JA ing Nepenthes sing dilemahake sensitif banget marang OSM, ing ngendi FAC bisa njaga aktivitase sanajan diencerake 1:1000 karo banyu (44). Mulane, dibandhingake karo OSM, sanajan FAC ing OSS1 sithik banget, cukup kanggo nyebabake wabah JA sing cukup. Panliten sadurungé wis nuduhaké yèn protein kaya porin (45) lan oligosakarida (46) bisa digunakaké minangka pitunjuk molekuler kanggo micu respon pertahanan tanduran ing OSS1. Nanging, isih durung cetha apa elisitor iki ing OSS1 tanggung jawab kanggo akumulasi JA sing diamati ing panliten saiki.
Sanajan ana sawetara panliten sing njlèntrèhaké sidik jari metabolik diferensial sing disebabake déning aplikasi herbivora sing béda utawa JA utawa SA eksogen (asam salisilat) (47), ora ana sing ngganggu gangguan spesifik spesies herbivora ing jaringan suket tanduran lan efeké marang informasi pribadi tartamtu. Analisis iki luwih ngonfirmasi manawa sambungan jaringan hormon internal karo hormon tanduran liyané kajaba JA mbentuk spesifisitas reorganisasi metabolik sing disebabake déning herbivora. Utamane, kita ndeteksi manawa ET sing disebabake dening OSM luwih gedhé tinimbang sing disebabake dening OSS1. Mode iki konsisten karo luwih akeh isi FAC ing OSM, sing minangka kondisi sing perlu lan cukup kanggo micu ledakan ET (48). Ing konteks interaksi antarane tanduran lan herbivora, fungsi sinyal ET ing dinamika metabolit spesifik tanduran isih sporadis lan mung nargetake klompok senyawa tunggal. Kajaba iku, umume panliten nggunakake aplikasi eksogen ET utawa prekursor utawa macem-macem inhibitor kanggo nyinaoni regulasi ET, ing antarane aplikasi kimia eksogen iki bakal ngasilake akeh efek samping sing ora spesifik. Sakwruh kawruh kita, panliten iki minangka pamriksaan sistematis skala gedhe pisanan babagan peran ET ing panggunaan ET kanggo ngasilake lan ndeleng tanduran transgenik sing cacat kanggo koordinasi dinamika metabolit tanduran. Induksi ET spesifik herbivora pungkasane bisa modulasi respon metabolit. Sing paling penting yaiku manipulasi transgenik gen biosintesis ET (ACO) lan persepsi (ETR1) sing nuduhake akumulasi fenolamida de novo spesifik herbivora. Sadurunge wis dituduhake yen ET bisa nyetel akumulasi nikotin sing diinduksi JA kanthi ngatur putrescine N-methyltransferase (49). Nanging, saka sudut pandang mekanik, ora jelas kepiye ET nyetel induksi fenamida. Saliyané fungsi transduksi sinyal ET, fluks metabolisme uga bisa digeser menyang S-adenosil-1-metionin kanggo ngatur investasi ing poliaminofenol amida. S-adenosil-1-metionin minangka ET lan perantara umum saka jalur biosintesis poliamina. Mekanisme sinyal ET ngatur tingkat fenolamida butuh panliten luwih lanjut.
Wis suwe, amarga akeh metabolit khusus sing strukture ora dingerteni, perhatian sing kuat marang kategori metabolisme tartamtu ora bisa netepake owah-owahan temporal saka keragaman metabolisme sawise interaksi biologis. Saiki, adhedhasar analisis teori informasi, asil utama saka akuisisi spektrum MS/MS adhedhasar metabolit sing ora bias yaiku herbivora sing mangan utawa simulasi herbivora terus nyuda keragaman metabolisme sakabèhé saka metabolit godhong nalika nambah derajat spesialisasine. Peningkatan sementara ing spesifisitas metabolit iki sing disebabake dening herbivora digandhengake karo peningkatan sinergis ing spesifisitas transkriptom. Fitur sing paling nyumbang kanggo spesialisasi metabolit sing luwih gedhe iki (nduweni nilai Si sing luwih dhuwur) yaiku metabolit khusus kanthi fungsi herbivora sing wis ditondoi sadurunge. Model iki konsisten karo prediksi teori OD, nanging prediksi MT sing ana gandhengane karo keacakan pemrograman ulang metabolom ora konsisten. Nanging, data iki uga konsisten karo prediksi model campuran (MT paling apik; Gambar 1B), amarga metabolit liyane sing ora dikarakterisasi kanthi fungsi pertahanan sing ora dingerteni isih bisa ngetutake distribusi Si acak.
Pola sing penting sing luwih direkam dening riset iki yaiku saka tingkat mikro-evolusi (populasi tanduran tunggal lan rokok) nganti skala evolusi sing luwih gedhe (spesies rokok sing raket banget), tingkat organisasi evolusi sing beda-beda ana ing "pertahanan paling apik". Ana bedane sing signifikan ing kemampuan herbivora. Moore et al. (20) lan Kessler lan Kalske (1) kanthi mandiri ngusulake kanggo ngowahi telung tingkat fungsional keanekaragaman hayati sing asline dibedakake dening Whittaker (50) dadi owah-owahan temporal konstitutif lan diinduksi saka keanekaragaman kimia; penulis iki ora ngringkes Prosedur kanggo pangumpulan data metabolit skala gedhe uga ora nggambarake carane ngetung keanekaragaman metabolik saka data kasebut. Ing panliten iki, pangaturan cilik kanggo klasifikasi fungsional Whittaker bakal nimbang keanekaragaman α-metabolik minangka keanekaragaman spektrum MS/MS ing tanduran tartamtu, lan keanekaragaman β-metabolik minangka metabolisme intraspesifik dhasar saka klompok populasi. Ruang, lan keanekaragaman γ-metabolik bakal dadi perpanjangan saka analisis spesies sing padha.
Sinyal JA penting banget kanggo macem-macem respon metabolisme herbivora. Nanging, durung ana uji kuantitatif sing ketat babagan kontribusi regulasi intraspesifik biosintesis JA kanggo keragaman metabolit, lan apa sinyal JA minangka situs umum kanggo diversifikasi metabolik sing disebabake stres ing skala makroevolusi sing luwih dhuwur isih angel dingerteni. Kita mirsani manawa sifat herbivora Nepenthes herbivora nyebabake spesialisasi metaboloma lan variasi spesialisasi metaboloma ing populasi spesies Nicotiana lan ing antarane spesies Nicotiana sing raket banget ana hubungane kanthi sistematis kanthi positif berkorelasi karo sinyal JA. Kajaba iku, nalika sinyal JA rusak, spesifisitas metabolik sing disebabake dening herbivora genotipe tunggal bakal dibatalake (Gambar 3, C lan E). Amarga owah-owahan spektrum metabolik saka populasi Nepenthes sing dilemahake sacara alami biasane kuantitatif, owah-owahan ing keragaman β metabolik lan spesifisitas ing analisis iki bisa uga disebabake dening eksitasi sing kuwat saka kategori senyawa sing sugih metabolit. Kelas senyawa iki ndominasi bagean saka profil metaboloma lan nyebabake korelasi positif karo sinyal JA.
Amarga mekanisme biokimia spesies tembakau sing raket banget karo iku beda banget, metabolit kasebut diidentifikasi kanthi khusus ing aspek kualitatif, mula luwih analitis. Pamrosesan profil metabolik sing dijupuk dening teori informasi nuduhake yen induksi herbivora nambah trade-off antarane keragaman gamma metabolik lan spesialisasi. Sinyal JA nduweni peran sentral ing trade-off iki. Peningkatan spesialisasi metabolom konsisten karo prediksi OD utama lan berkorelasi positif karo sinyal JA, dene sinyal JA berkorelasi negatif karo keragaman gamma metabolik. Model kasebut nuduhake yen kapasitas OD tanduran utamane ditemtokake dening plastisitas JA, apa ing skala mikroevolusi utawa ing skala evolusi sing luwih gedhe. Eksperimen aplikasi JA eksogen sing ngliwati cacat biosintesis JA luwih lanjut nuduhake yen spesies tembakau sing raket banget bisa dibedakake dadi spesies sing responsif sinyal lan ora responsif sinyal, kaya mode JA lan plastisitas metabolom sing disebabake dening herbivora. Spesies sing ora responsif sinyal ora bisa nanggapi amarga ora bisa ngasilake JA endogen lan mulane tundhuk karo watesan fisiologis. Iki bisa uga disebabake dening mutasi ing sawetara gen kunci ing jalur sinyal JA (AOS lan JAR4 ing N. crescens). Asil iki nyoroti manawa pola makroevolusi antarspesies iki bisa uga utamane didorong dening owah-owahan ing persepsi lan responsif hormon internal.
Saliyané interaksi antarané tetuwuhan lan herbivora, eksplorasi keragaman metabolisme ana gandhèngané karo kabèh kemajuan téoritis penting ing riset adaptasi biologis marang lingkungan lan évolusi sipat fenotipik sing kompleks. Kanthi tambahing jumlah data sing dipikolehi déning instrumen MS modern, uji hipotesis babagan keragaman metabolisme saiki bisa ngluwihi bédané metabolit individu/kategori lan nindakaké analisis global kanggo ngungkapaké pola sing ora dikarepaké. Ing proses analisis skala gedhé, metafora sing penting yaiku ide kanggo nggawé peta sing migunani sing bisa digunakaké kanggo njelajah data. Mula, asil penting saka kombinasi metabolomik MS/MS sing ora bias lan téori informasi saiki yaiku nyedhiyakake metrik prasaja sing bisa digunakaké kanggo nggawé peta kanggo nelusuri keragaman metabolisme ing skala taksonomi sing béda. Iki minangka syarat dhasar saka metode iki. Sinau babagan évolusi mikro/makro lan ékologi komunitas.
Ing tingkat makro-evolusi, inti saka teori ko-evolusi tanduran-serangga saka Ehrlich lan Raven (51) yaiku kanggo prédhiksi manawa variasi keragaman metabolik antarspesies minangka panyebab diversifikasi garis keturunan tanduran. Nanging, sajrone sèket taun wiwit publikasi karya penting iki, hipotesis iki arang dites (52). Iki umumé amarga karakteristik filogenetik saka karakteristik metabolik sing bisa dibandhingake ing garis keturunan tanduran jarak jauh. Kelangkaan iki bisa digunakake kanggo jangkar metode analisis target. Alur kerja MS/MS saiki sing diproses dening teori informasi ngetung kamiripan struktural MS/MS saka metabolit sing ora dingerteni (tanpa pilihan metabolit sadurunge) lan ngowahi MS/MS iki dadi sakumpulan MS/MS, mula ing metabolisme profesional Model makro-evolusi iki dibandhingake ing skala klasifikasi. Indikator statistik prasaja. Proses iki padha karo analisis filogenetik, sing bisa nggunakake penyelarasan urutan kanggo ngetung tingkat diversifikasi utawa evolusi karakter tanpa prediksi sadurunge.
Ing tingkat biokimia, hipotesis skrining Firn lan Jones (53) nuduhake manawa keragaman metabolisme dijaga ing tingkat sing beda-beda kanggo nyedhiyakake bahan mentah kanggo nindakake aktivitas biologis metabolit sing sadurunge ora ana hubungane utawa diganti. Metode teori informasi nyedhiyakake kerangka kerja ing ngendi transisi evolusi spesifik metabolit iki sing kedadeyan sajrone spesialisasi metabolit bisa diukur minangka bagean saka proses skrining evolusi sing diusulake: adaptasi aktif biologis saka spesifisitas rendah nganti spesifisitas dhuwur. Metabolit sing dicegah saka lingkungan tartamtu.
Sakabèhé, ing jaman awal biologi molekuler, téori pertahanan tanduran sing penting dikembangaké, lan metode sing didorong hipotesis deduktif dianggep minangka siji-sijiné cara kanggo kemajuan ilmiah. Iki umumé amarga watesan teknis ngukur kabèh metabolit. Sanajan metode sing didorong hipotesis migunani banget kanggo milih mekanisme sebab akibat liyané, kemampuané kanggo ningkataké pangerten kita babagan jaringan biokimia luwih winates tinimbang metode komputasi sing saiki kasedhiya ing ilmu intensif data kontemporer. Mulane, téori sing ora bisa diprediksi adoh ngluwihi ruang lingkup data sing kasedhiya, mula formula/siklus uji hipotetis kemajuan ing bidang riset ora bisa diilangi (4). Kita ngramal manawa alur kerja komputasi metabolomik sing dikenalaké ing kéné bisa nguripaké manèh minat ing masalah anyar (kepriyé) lan pungkasan (kenapa) babagan keragaman metabolik, lan nyumbang kanggo jaman anyar ilmu data sing dipandu sacara téoritis. Jaman kasebut mriksa manèh téori-téori penting sing nginspirasi generasi sadurungé.
Pakan herbivora langsung ditindakake kanthi ngunggahake larva instar kapindho utawa larva Sl ing godhong tanduran kantong semar warna pucet saka tanduran mawar sing mekar, kanthi 10 ulangan tanduran saben tanduran. Larva serangga dijepit nganggo klem, lan jaringan godhong sing isih ana dikumpulake 24 lan 72 jam sawise infeksi lan dibekukan kanthi cepet, lan metabolite diekstrak.
Simulasi perawatan herbivora kanthi cara sing sinkron banget. Carané yaiku nggunakake roda pola kain kanggo nusuk telung larik eri ing saben sisih iga saka telung godhong tanduran sing wis ngembang kanthi lengkap sajrone tahap pertumbuhan karangan kain, lan langsung ngolesake Ms sing wis diencerake 1:5. Utawa gunakake driji sing nganggo sarung tangan kanggo masang S1 OS menyang tatu tusukan. Panen lan proses godhong kaya sing diterangake ing ndhuwur. Gunakake cara sing diterangake sadurunge kanggo ngekstrak metabolit primer lan hormon tanduran (54).
Kanggo aplikasi JA eksogen, telung godhong tangkai godhong saka saben enem tanduran mawar sing mekar saka saben spesies diolah nganggo 20μl pasta lanolin sing ngemot 150μg MeJA (Lan + MeJA), lan 20μl lanolin ditambah perawatan tatu (Lan + W), utawa gunakake 20μl lanolin murni minangka kontrol. Godhong-godhong kasebut dipanen 72 jam sawise perawatan, dibekukan ing nitrogen cair, lan disimpen ing suhu -80°C nganti digunakake.
Papat galur transgenik JA lan ET, yaiku irAOC (36), irCOI1 (55), irACO lan sETR1 (48), wis diidentifikasi ing klompok riset kita. irAOC nuduhake penurunan tingkat JA lan JA-Ile kanthi kuat, dene irCOI1 ora sensitif marang JA. Dibandhingake karo EV, akumulasi JA-Ile mundhak. Kajaba iku, irACO bakal nyuda produksi ET, lan dibandhingake karo EV, sETR1, sing ora sensitif marang ET, bakal nambah produksi ET.
Spektrometer laser fotoakustik (sensor ET wektu nyata Sensor Sense ETD-300) digunakake kanggo nindakake pangukuran ET kanthi non-invasif. Sanalika sawise perawatan, setengah saka godhong dipotong lan ditransfer menyang botol kaca sing disegel 4 ml, lan ruang ndhuwur diidini nglumpuk sajrone 5 jam. Sajrone pangukuran, saben botol dibilas nganggo aliran udara murni 2 liter/jam sajrone 8 menit, sing sadurunge wis ngliwati katalis sing diwenehake dening Sensor Sense kanggo mbusak CO2 lan banyu.
Data microarray asline diterbitake ing (35) lan disimpen ing National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (nomer aksesi GSE30287). Data sing cocog karo godhong sing disebabake dening perawatan W + OSM lan kontrol sing ora rusak diekstrak kanggo panliten iki. Intensitas mentah yaiku log2. Sadurunge analisis statistik, garis dasar diowahi lan dinormalisasi menyang persentil kaping 75 nggunakake paket piranti lunak R.
Data sekuensing RNA asli (RNA-seq) saka spesies Nicotiana dijupuk saka NCBI Short Reading Archives (SRA), nomer proyek yaiku PRJNA301787, sing dilapurake dening Zhou et al. (39) lan nerusake kaya sing diterangake ing (56). Data mentah sing diproses dening W + W, W + OSM lan W + OSS1 sing cocog karo spesies Nicotiana dipilih kanggo analisis ing panliten iki, lan diproses kanthi cara ing ngisor iki: Kapisan, bacaan RNA-seq mentah diowahi dadi format FASTQ. HISAT2 ngowahi FASTQ dadi SAM, lan SAMtools ngowahi file SAM dadi file BAM sing diurutake. StringTie digunakake kanggo ngetung ekspresi gen, lan metode ekspresine yaiku ana fragmen saben sewu fragmen basa saben yuta fragmen transkripsi sing diurutake.
Kolom kromatografi Acclaim (150 mm x 2,1 mm; ukuran partikel 2,2μm) sing digunakake ing analisis lan kolom pelindung 4 mm x 4 mm kasusun saka bahan sing padha. Gradien biner ing ngisor iki digunakake ing sistem Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC): 0 nganti 0,5 menit, isokratik 90% A [banyu deionisasi, 0,1% (v/v) asetonitril lan 0,05% asam format], 10% B (Asetonitril lan 0,05% asam format); 0,5 nganti 23,5 menit, fase gradien yaiku 10% A lan 90% B, masing-masing; 23,5 nganti 25 menit, isokratik 10% A lan 90% B. Laju aliran yaiku 400μl/menit. Kanggo kabeh analisis MS, suntikake eluen kolom menyang penganalisis quadrupole lan time-of-flight (qTOF) sing dilengkapi sumber electrospray sing beroperasi ing mode ionisasi positif (tegangan kapiler, 4500 V; outlet kapiler 130 V; Suhu pangatusan 200°C; aliran udara pangatusan 10 liter/menit).
Nindakake analisis fragmen MS / MS (sabanjure diarani MS / MS) sing ora relevan utawa ora bisa dibedakake saka data kanggo entuk informasi struktural babagan profil metabolik sing bisa dideteksi sakabèhé. Konsep metode MS / MS sing ora bisa dibedakake gumantung marang kasunyatan manawa quadrupole duwe jendela isolasi massa sing gedhe banget [mula, anggep kabeh sinyal rasio massa-kanggo-muatan (m / z) minangka fragmen]. Amarga alasan iki, amarga instrumen Impact II ora bisa nggawe kemiringan CE, sawetara analisis independen ditindakake nggunakake nilai energi tabrakan disosiasi (CE) sing disebabake tabrakan. Cekakipun, analisis sampel dhisik kanthi ionisasi elektrospray UHPLC / qTOF-MS nggunakake mode spektrometri massa tunggal (kondisi fragmentasi rendah sing diasilake dening fragmentasi ing sumber), mindhai saka m / z 50 nganti 1500 kanthi frekuensi pengulangan 5 Hz. Gunakake nitrogen minangka gas tabrakan kanggo analisis MS / MS, lan tindakake pangukuran independen ing papat voltase disosiasi sing disebabake tabrakan sing beda ing ngisor iki: 20, 30, 40, lan 50 eV. Sajrone proses pangukuran, quadrupole nduweni jendela isolasi massa paling gedhe, saka m/z 50 nganti 1500. Nalika awak ngarep m/z lan eksperimen jembar isolasi disetel dadi 200, rentang massa diaktifake kanthi otomatis dening piranti lunak operasi instrumen lan 0 Da. Pindai fragmen massa kaya ing mode massa tunggal. Gunakake natrium format (50 ml isopropanol, 200 μl asam format lan 1 ml larutan banyu NaOH 1M) kanggo kalibrasi massa. Nggunakake algoritma kalibrasi presisi dhuwur Bruker, file data dikalibrasi sawise mbukak spektrum rata-rata ing periode wektu tartamtu. Gunakake fungsi ekspor piranti lunak Analisis Data v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Jerman) kanggo ngowahi file data mentah dadi format NetCDF. Set data MS/MS wis disimpen ing basis data metabolomik terbuka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) kanthi nomer aksesi. MTBLS1471.
Perakitan MS/MS bisa direalisasikake liwat analisis korelasi antarane sinyal kualitas MS1 lan MS/MS kanggo energi tabrakan sing endhek lan dhuwur sarta aturan sing nembe dileksanakake. Skrip R digunakake kanggo ngrealisasikake analisis korelasi distribusi prekursor menyang produk, lan skrip C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) digunakake kanggo ngetrapake aturan kasebut.
Kanggo ngurangi kesalahan positif palsu sing disebabake dening gangguan latar mburi lan korelasi palsu sing disebabake dening ndeteksi fitur m/z tartamtu mung ing sawetara sampel, kita nggunakake fungsi "puncak sing diisi" saka paket R XCMS (kanggo koreksi gangguan latar mburi) Kudune digunakake kanggo ngganti intensitas "NA" (puncak sing ora dideteksi). Nalika fungsi puncak isi digunakake, isih ana akeh nilai intensitas "0" ing set data sing bakal mengaruhi pitungan korelasi. Banjur, kita mbandhingake asil pangolahan data sing dipikolehi nalika fungsi puncak sing diisi digunakake lan nalika fungsi puncak sing diisi ora digunakake, lan ngetung nilai gangguan latar mburi adhedhasar nilai perkiraan rata-rata sing dikoreksi, banjur ngganti nilai intensitas 0 iki karo nilai latar mburi sing diitung. Kita uga mung nimbang fitur sing intensitase ngluwihi kaping telu nilai latar mburi lan nganggep minangka "puncak sejati." Kanggo pitungan PCC, mung sinyal m/z saka prekursor sampel (MS1) lan set data fragmen kanthi paling ora wolung puncak sejati sing dianggep.
Yen intensitas fitur kualitas prekursor ing kabeh sampel berkorelasi sacara signifikan karo intensitas sing suda saka fitur kualitas sing padha sing kena energi tabrakan sing endhek utawa dhuwur, lan fitur kasebut ora diwenehi label minangka puncak isotop dening CAMERA, bisa ditetepake luwih lanjut. Banjur, kanthi ngetung kabeh pasangan prekursor-produk sing bisa ditindakake sajrone 3 detik (jendela wektu retensi sing diestimasikake kanggo retensi puncak), analisis korelasi ditindakake. Mung nalika nilai m/z luwih murah tinimbang nilai prekursor lan fragmentasi MS/MS kedadeyan ing lokasi sampel sing padha ing set data minangka prekursor saka ngendi asale, mula dianggep minangka fragmen.
Adhedhasar rong aturan prasaja iki, kita ngilangi fragmen sing ditemtokake kanthi nilai m/z sing luwih gedhe tinimbang m/z saka prekursor sing diidentifikasi, lan adhedhasar posisi sampel ing ngendi prekursor katon lan fragmen sing ditemtokake. Uga bisa milih fitur kualitas sing diasilake dening akeh fragmen sumber sing diasilake ing mode MS1 minangka prekursor kandidat, saengga ngasilake senyawa MS/MS sing berlebihan. Kanggo nyuda redundansi data iki, yen kamiripan NDP saka spektrum ngluwihi 0,6, lan kalebu kromatogram "pcgroup" sing dianotasi dening CAMERA, kita bakal nggabungake. Pungkasan, kita nggabungake kabeh papat asil CE sing ana gandhengane karo prekursor lan fragmen menyang spektrum komposit dekonvolusi pungkasan kanthi milih puncak intensitas paling dhuwur ing antarane kabeh puncak kandidat kanthi nilai m/z sing padha ing energi tabrakan sing beda. Langkah-langkah pangolahan sabanjure adhedhasar konsep spektrum komposit lan nganggep macem-macem kahanan CE sing dibutuhake kanggo ngoptimalake kemungkinan fragmentasi, amarga sawetara fragmen mung bisa dideteksi ing energi tabrakan tartamtu.
RDPI (30) digunakake kanggo ngetung induktibilitas profil metabolik. Keragaman spektrum metabolik (indeks Hj) asale saka akehe prekursor MS/MS nggunakake entropi Shannon saka distribusi frekuensi MS/MS nggunakake persamaan ing ngisor iki sing diterangake dening Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) ing ngendi Pij cocog karo frekuensi relatif MS/MS kaping-i ing sampel kaping-j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
Spesifisitas metabolik (indeks Si) ditegesake minangka identitas ekspresi MS/MS sing diwenehake gegayutan karo frekuensi antarane sampel sing ditimbang. Spesifisitas MS/MS diitung minangka Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gunakna rumus ing ngisor iki kanggo ngukur indeks δj spesifik metabolit saben sampel j, lan rata-rata spesifisitas MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektrum MS/MS dijajarake kanthi pasangan, lan kamiripan diitung adhedhasar rong skor kasebut. Kapisan, nggunakake NDP standar (uga dikenal minangka metode korelasi kosinus), gunakake persamaan ing ngisor iki kanggo menehi skor kamiripan segmen antarane spektrum NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ing ngendi S1 ​​lan S2. Sabanjure, kanggo spektrum 1 lan spektrum 2, uga WS1, i lan WS2, i makili bobot adhedhasar intensitas puncak yen bedane puncak umum kaping-i antarane rong spektrum kurang saka 0,01 Da. Bobot diitung kaya ing ngisor iki: W = [intensitas puncak] m [kualitas] n, m = 0,5, n = 2, kaya sing disaranake dening MassBank.
Cara penilaian kapindho ditindakake, sing kalebu nganalisis NL sing dienggo bareng antarane MS/MS. Kanggo tujuan iki, kita nggunakake 52 dhaptar NL sing kerep ditemokake sajrone proses fragmentasi MS bebarengan, lan NL sing luwih spesifik (file data S1) sing wis dianotasi sadurunge kanggo spektrum MS/MS saka metabolit sekunder saka spesies Nepenthes sing wis ringkih (9, 26). Gawe vektor biner 1 lan 0 kanggo saben MS/MS, sing cocog karo saiki lan ora ana saka sawetara NL. Adhedhasar kamiripan jarak Euclidean, skor kamiripan NL diitung kanggo saben pasangan vektor NL biner.
Kanggo nindakake klaster ganda, kita nggunakake paket R DiffCoEx, sing adhedhasar ekstensi saka Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Nggunakake matriks skor NDP lan NL saka spektrum MS/MS, kita nggunakake DiffCoEx kanggo ngetung matriks korelasi komparatif. Klaster biner ditindakake kanthi nyetel parameter "cutreeDynamic" dadi metode = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, lan minClusterSize = 10. Kode sumber R saka DiffCoEx diunduh saka file tambahan 1 dening Tesson et al. (57); Paket piranti lunak R WGCNA sing dibutuhake bisa ditemokake ing https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Kanggo nindakake analisis jaringan molekuler MS/MS, kita ngetung konektivitas spektral sing dipasangake adhedhasar jinis similaritas NDP lan NL, lan nggunakake piranti lunak Cytoscape kanggo nggambarake topologi jaringan nggunakake tata letak organik ing aplikasi ekstensi algoritma tata letak CyFilescape yFiles.
Gunakna R versi 3.0.1 kanggo nindakake analisis statistik marang data kasebut. Signifikansi statistik ditaksir nggunakake analisis varians rong arah (ANOVA), banjur uji post-hoc bedane sing signifikan kanthi jujur ​​​​Tukey (HSD). Kanggo nganalisis bedane antarane perawatan herbivora lan kontrol, distribusi rong sisi saka rong klompok sampel kanthi varians sing padha dianalisis nggunakake uji t Student.
Kanggo materi tambahan kanggo artikel iki, mangga deleng http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Iki minangka artikel akses terbuka sing disebarake miturut syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sing ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi ing media apa wae, anggere panggunaan pungkasan ora kanggo keuntungan komersial lan premise yaiku karya asline bener. Referensi.
Cathetan: Kita mung njaluk sampeyan menehi alamat email supaya wong sing sampeyan rekomendasikake menyang kaca kasebut ngerti yen sampeyan pengin dheweke ndeleng email kasebut lan dudu spam. Kita ora bakal nangkep alamat email apa wae.
Pitakonan iki digunakake kanggo nguji apa sampeyan pengunjung lan nyegah kiriman spam otomatis.
Teori informasi nyedhiyakake mata uang universal kanggo mbandhingake metabolit khusus lan prediksi teori pertahanan uji.
Teori informasi nyedhiyakake mata uang universal kanggo mbandhingake metabolit khusus lan prediksi teori pertahanan uji.
© 2021 American Association for the Advancement of Science. kabeh hak dilindhungi undhang-undhang. AAAS minangka mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef lan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.