Sadurunge, kita wis nglaporake manawa tingkat serum metabolit triptofan sing asale saka usus, asam indole-3-propionat (IPA) luwih murah ing pasien fibrosis ati. Ing panliten iki, kita nyelidiki transkriptom lan metilom DNA ing ati sing obesitas gegayutan karo tingkat IPA serum, uga peran IPA ing ngindhuksi inaktivasi fenotipik sel stellata hepatik (HSC) in vitro.
Panliten iki nglibatake 116 pasien obesitas tanpa diabetes mellitus tipe 2 (T2DM) (umur 46,8 ± 9,3 taun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) sing nglakoni operasi bariatrik ing Pusat Bedah Bariatrik Kuopio (KOBS). Tingkat IPA sing sirkulasi diukur nganggo kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), analisis transkriptom ati ditindakake nganggo sekuensing RNA total, lan analisis metilasi DNA ditindakake nganggo Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Sel stellata hepatik manungsa (LX-2) digunakake kanggo eksperimen in vitro.
Kadar IPA serum ana hubungane karo ekspresi gen sing terlibat ing jalur apoptosis, mitofagik, lan umur dawa ing ati. Gen AKT serine/treonine kinase 1 (AKT1) minangka gen interaksi sing paling akeh lan dominan ing transkrip ati lan profil metilasi DNA. Perawatan IPA nyebabake apoptosis, nyuda respirasi mitokondria, lan ngowahi morfologi sel lan dinamika mitokondria kanthi modulasi ekspresi gen sing dikenal ngatur fibrosis, apoptosis, lan kaslametané sel LX-2.
Yen digabungake, data iki ndhukung manawa IPA nduweni efek terapeutik potensial lan bisa nyebabake apoptosis lan ngowahi fenotipe HSC menyang kahanan ora aktif, saengga ngembangake kemungkinan nyegah fibrosis ati kanthi ngganggu aktivasi HSC lan metabolisme mitokondria.
Prevalensi obesitas lan sindrom metabolik wis digandhengake karo tambahing insiden penyakit ati berlemak sing ana gandhengane karo metabolisme (MASLD); penyakit iki mengaruhi 25% nganti 30% saka populasi umum [1]. Akibat utama saka etiologi MASLD yaiku fibrosis ati, proses dinamis sing ditondoi dening akumulasi matriks ekstraseluler fibrosa (ECM) sing terus-terusan [2]. Sel utama sing terlibat ing fibrosis ati yaiku sel stellata hepatik (HSC), sing nuduhake papat fenotipe sing dikenal: quiescent, activated, inactivated, lan senescent [3, 4]. HSC bisa diaktifake lan transdifferensiasi saka bentuk quiescent dadi sel kaya fibroblast proliferatif kanthi tuntutan energi sing dhuwur, kanthi tambah ekspresi aktin otot polos α (α-SMA) lan kolagen tipe I (Col-I) [5, 6]. Sajrone pembalikan fibrosis ati, HSC sing diaktifake diilangi liwat apoptosis utawa inaktivasi. Proses-proses iki kalebu downregulation gen fibrogenik lan modulasi gen prosurvival (kayata jalur sinyal NF-κB lan PI3K/Akt) [7, 8], uga owah-owahan ing dinamika lan fungsi mitokondria [9].
Kadar serum metabolit triptofan asam indole-3-propionat (IPA), sing diprodhuksi ing usus, wis ditemokake mudhun ing penyakit metabolisme manungsa kalebu MASLD [10-13]. IPA digandhengake karo asupan serat pangan, dikenal amarga efek antioksidan lan anti-inflamasi, lan ngurangi fenotipe steatohepatitis non-alkohol (NASH) sing diinduksi diet in vivo lan in vitro [11-14]. Sawetara bukti asale saka panliten sadurunge, sing nuduhake yen kadar IPA serum luwih murah ing pasien fibrosis ati tinimbang pasien obesitas tanpa fibrosis ati ing Studi Bedah Bariatrik Kuopio (KOBS). Salajengipun, kita nuduhake yen perawatan IPA bisa nyuda ekspresi gen sing minangka penanda klasik adhesi sel, migrasi sel lan aktivasi sel punca hematopoietik ing model sel stellata hepatik manungsa (LX-2) lan minangka metabolit hepatoprotektif potensial [15]. Nanging, isih durung jelas kepiye IPA nyebabake regresi fibrosis ati kanthi ngaktifake apoptosis HSC lan bioenergetika mitokondria.
Ing kene, kita nduduhake manawa serum IPA ana gandhengane karo ekspresi gen sing sugih ing apoptosis, mitophagy, lan jalur umur dawa ing ati individu sing obesitas nanging ora duwe diabetes tipe 2 (KOBS). Salajengipun, kita nemokake manawa IPA bisa nyebabake pembersihan lan degradasi sel punca hematopoietik (HSC) sing diaktifake liwat jalur inaktivasi. Asil kasebut nuduhake peran anyar kanggo IPA, dadi target terapi potensial kanggo ningkatake regresi fibrosis ati.
Panliten sadurunge ing kohort KOBS nuduhake yen pasien kanthi fibrosis ati duwe tingkat IPA sirkulasi sing luwih murah dibandhingake karo pasien tanpa fibrosis ati [15]. Kanggo ngilangi efek pengganggu potensial saka diabetes tipe 2, kita ngrekrut 116 pasien obesitas tanpa diabetes tipe 2 (umur rata-rata ± SD: 46,8 ± 9,3 taun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) saka panliten KOBS sing lagi ditindakake minangka populasi panliten [16]. Kabeh peserta menehi idin tertulis lan protokol panliten disetujoni dening Komite Etik Rumah Sakit Kabupaten Savo Lor miturut Deklarasi Helsinki (54/2005, 104/2008 lan 27/2010).
Spesimen biopsi ati dijupuk nalika operasi bariatrik lan ditaksir sacara histologis dening ahli patologi sing berpengalaman miturut kriteria sing wis diterangake sadurunge [17, 18]. Kriteria penilaian dirangkum ing Tabel Tambahan S1 lan wis diterangake sadurunge [19].
Sampel serum pasa dianalisis nganggo kromatografi cair-spektrometri massa tanpa target (LC-MS) kanggo analisis metabolomik (n = 116). Sampel dianalisis nganggo sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Jerman) kaya sing wis diterangake sadurunge19. Identifikasi alkohol isopropil (IPA) adhedhasar wektu retensi lan perbandingan spektrum MS/MS karo standar murni. Intensitas sinyal IPA (area puncak) dianggep ing kabeh analisis luwih lanjut [20].
Sekuensing RNA ati sakabèhé ditindakake nggunakake Illumina HiSeq 2500 lan data wis diolah kaya sing wis diterangake sadurunge [19, 21, 22]. Kita nindakake analisis ekspresi diferensial sing ditargetake saka transkrip sing mengaruhi fungsi/biogenesis mitokondria nggunakake 1957 gen sing dipilih saka basis data MitoMiner 4.0 [23]. Analisis metilasi DNA ati ditindakake nggunakake Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) nggunakake metodologi sing padha karo sing diterangake sadurunge [24, 25].
Sel stellata hepatik manungsa (LX-2) diwenehake kanthi becik dening Prof. Stefano Romeo lan dikultur lan dijaga ing medium DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Kanggo milih dosis kerja IPA, sel LX-2 diobati nganggo konsentrasi IPA sing beda-beda (10 μM, 100 μM lan 1 mM; Sigma, 220027) ing medium DMEM/F12 sajrone 24 jam. Salajengipun, kanggo nyelidiki kemampuan IPA kanggo ngnonaktifake HSC, sel LX-2 diobati bebarengan karo 5 ng/ml TGF-β1 (sistem R&D, 240-B-002/CF) lan 1 mM IPA ing medium bebas serum sajrone 24 jam. Kanggo kontrol kendaraan sing cocog, 4 nM HCL sing ngandhut 0,1% BSA digunakake kanggo perawatan TGF-β1 lan 0,05% DMSO digunakake kanggo perawatan IPA, lan kalorone digunakake bebarengan kanggo perawatan kombinasi.
Apoptosis ditaksir nggunakake FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit karo 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) miturut pandhuan pabrikan. Cekakipun, LX-2 (1 × 105 sel/sumur) dikultur sewengi ing piring 12-sumur lan banjur diobati nganggo pirang-pirang dosis IPA utawa IPA lan TGF-β1. Dina candhake, sel sing ngambang lan nempel dikumpulake, ditripsinasi, dicuci nganggo PBS, disuspensi maneh ing buffer pengikat Annexin V, lan diinkubasi karo FITC-Annexin V lan 7-AAD sajrone 15 menit.
Mitokondria ing sel urip diwernani kanggo aktivitas oksidatif nggunakake Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Kanggo uji MTR, sel LX-2 diinkubasi kanthi kapadhetan sing padha karo IPA lan TGF-β1. Sawise 24 jam, sel urip ditripsinasi, dicuci nganggo PBS, banjur diinkubasi karo 100 μM MTR ing medium bebas serum ing suhu 37 °C sajrone 20 menit kaya sing diterangake sadurunge [26]. Kanggo analisis morfologi sel urip, ukuran sel lan kompleksitas sitoplasma dianalisis nggunakake parameter forward scatter (FSC) lan side scatter (SSC).
Kabeh data (30.000 kedadeyan) dipikolehi nggunakake NovoCyte Quanteon (Agilent) lan dianalisis nggunakake NovoExpress® 1.4.1 utawa piranti lunak FlowJo V.10.
Tingkat konsumsi oksigen (OCR) lan tingkat pengasaman ekstraseluler (ECAR) diukur kanthi wektu nyata nggunakake Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sing dilengkapi Seahorse XF Cell Mito Stress miturut pandhuan pabrikan. Secara ringkes, 2 × 104 sel LX-2/sumur disebar ing piring kultur sel XF96. Sawise inkubasi sewengi, sel diolah nganggo isopropanol (IPA) lan TGF-β1 (Metode Tambahan 1). Analisis data ditindakake nggunakake piranti lunak Seahorse XF Wave, sing kalebu Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Saka iki, Indeks Kesehatan Bioenergetik (BHI) diitung [27].
RNA total ditranskripsi dadi cDNA. Kanggo metode tartamtu, deleng referensi [15]. Tingkat mRNA protein asam ribosom 60S manungsa P0 (RPLP0) lan siklofilin A1 (PPIA) digunakake minangka kontrol gen konstitutif. Sistem PCR Real-Time QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Walanda) digunakake karo TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) utawa Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), lan lipatan ekspresi gen relatif diitung nggunakake parameter siklus nilai Ct komparatif (ΔΔCt) lan metode ∆∆Ct. Rincian primer diwenehake ing Tabel Tambahan S2 lan S3.
DNA nuklir (ncDNA) lan DNA mitokondria (mtDNA) diekstrak nggunakake kit getih lan jaringan DNeasy (Qiagen) kaya sing diterangake sadurunge [28]. Jumlah relatif mtDNA diitung kanthi ngetung rasio saben wilayah mtDNA target karo rata-rata geometris saka telung wilayah DNA nuklir (mtDNA/ncDNA), kaya sing dirinci ing Metode Tambahan 2. Rincian primer kanggo mtDNA lan ncDNA diwenehake ing Tabel Tambahan S4.
Sel urip diwernani nganggo Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) kanggo nggambarake jaringan mitokondria antar sel lan intraseluler. Sel LX-2 (1 × 104 sel/sumur) dikultur ing slide kaca ing piring kultur kaca sing cocog (Ibidi GmbH, Martinsried, Jerman). Sawise 24 jam, sel LX-2 urip diinkubasi nganggo 100 μM MTR sajrone 20 menit ing suhu 37 °C lan inti sel diwernani nganggo DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kaya sing diterangake sadurunge [29]. Jaringan mitokondria divisualisasikake nggunakake mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman) sing dilengkapi modul confocal Zeiss LSM 800 ing suhu 37 °C ing atmosfer sing lembab kanthi 5% CO2 nggunakake objektif 63 × NA 1.3. Kita entuk sepuluh gambar seri-Z kanggo saben jinis sampel. Saben seri Z ngandhut 30 bagean, saben bagean kanthi kekandelan 9,86 μm. Kanggo saben sampel, gambar saka sepuluh bidang pandang sing beda-beda dijupuk nggunakake piranti lunak ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman), lan analisis morfologi mitokondria ditindakake nggunakake piranti lunak ImageJ (v1.54d) [30, 31] miturut parameter sing dirinci ing Metode Tambahan 3.
Sel-sel kasebut difiksasi nganggo glutaraldehida 2% ing buffer fosfat 0,1 M, banjur difiksasi nganggo larutan osmium tetroksida 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), didehidrasi kanthi bertahap nganggo aseton (Merck, Darmstadt, Jerman), lan pungkasane dilebokake ing resin epoksi. Bagian ultra tipis disiapake lan diwernani nganggo uranil asetat 1% (Merck, Darmstadt, Jerman) lan 1% timbal sitrat (Merck, Darmstadt, Jerman). Gambar ultrastruktural dipikolehi nggunakake mikroskop elektron transmisi JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Jepang) kanthi voltase akselerasi 80 kV.
Morfologi sel LX-2 sing diobati nganggo IPA sajrone 24 jam dianalisis nganggo mikroskop fase-kontras kanthi pembesaran 50x nggunakake mikroskop cahya terbalik Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 lan AxioCam MRm, Jena, Jerman).
Data klinis dinyatakake minangka rata-rata ± deviasi standar utawa median (rentang interkuartil: IQR). Analisis varians siji arah (variabel kontinyu) utawa uji χ² (variabel kategorik) digunakake kanggo mbandhingake bedane antarane telung klompok panliten. Tingkat positif palsu (FDR) digunakake kanggo mbenerake pirang-pirang tes, lan gen kanthi FDR <0,05 dianggep signifikan sacara statistik. Analisis korelasi Spearman digunakake kanggo nggandhengake metilasi DNA CpG karo intensitas sinyal IPA, kanthi nilai p nominal (p <0,05) sing dilapurake.
Analisis jalur ditindakake nggunakake alat analisis set gen berbasis web (WebGestalt) kanggo 268 transkrip (nominal p < 0,01), 119 transkrip sing ana gandhengane karo mitokondria (nominal p < 0,05), lan 4350 CpG saka 3093 transkrip ati sing ana gandhengane karo tingkat IPA serum sing sirkulasi. Alat Venny DB (versi 2.1.0) sing kasedhiya kanthi gratis digunakake kanggo nemokake gen sing tumpang tindih, lan StringDB (versi 11.5) digunakake kanggo nggambarake interaksi protein-protein.
Kanggo eksperimen LX-2, sampel diuji normalitas nggunakake uji D'Agostino-Pearson. Data dijupuk saka paling ora telung replikasi biologis lan ditindakake ANOVA siji arah nganggo uji post hoc Bonferroni. Nilai-p kurang saka 0,05 dianggep signifikan sacara statistik. Data ditampilake minangka rata-rata ± SD, lan jumlah eksperimen dituduhake ing saben gambar. Kabeh analisis lan grafik ditindakake nggunakake piranti lunak statistik GraphPad Prism 8 kanggo Windows (GraphPad Software Inc., versi 8.4.3, San Diego, USA).
Kapisan, kita nyelidiki hubungan tingkat IPA serum karo transkrip ati, awak sakabèhé, lan mitokondria. Ing profil transkrip total, gen paling kuat sing ana gandhèngané karo tingkat IPA serum yaiku MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protein kinase sing diaktifake mitogen-protein kinase 3); ing profil transkrip sing ana gandhèngané karo mitokondria, gen sing paling kuat sing ana gandhèngané yaiku AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treonin kinase 1) (File tambahan 1 lan File tambahan 2).
Banjur kita nganalisa transkrip global (n = 268; p < 0,01) lan transkrip sing ana gandhengane karo mitokondria (n = 119; p < 0,05), sing pungkasane ngenali apoptosis minangka jalur kanonik sing paling signifikan (p = 0,0089). Kanggo transkrip mitokondria sing ana gandhengane karo tingkat IPA serum, kita fokus ing apoptosis (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029), lan jalur sinyal TNF (FDR = 0,000006) (Gambar 1A, Tabel 2, lan Gambar Tambahan 1A-B).
Analisis tumpang tindih transkrip global, sing ana gandhengane karo mitokondria, lan metilasi DNA ing ati manungsa sing ana gandhengane karo tingkat IPA serum. A nggambarake 268 transkrip global, 119 transkrip sing ana gandhengane karo mitokondria, lan transkrip DNA sing dimetilasi sing dipetakan menyang 3092 situs CpG sing ana gandhengane karo tingkat IPA serum (nilai p < 0,01 kanggo transkrip global lan DNA sing dimetilasi, lan nilai p < 0,05 kanggo transkrip mitokondria). Transkrip tumpang tindih utama dituduhake ing tengah (AKT1 lan YKT6). B Peta interaksi 13 gen kanthi skor interaksi paling dhuwur (0,900) karo gen liyane digawe saka 56 gen sing tumpang tindih (wilayah garis ireng) sing ana gandhengane kanthi signifikan karo tingkat IPA serum nggunakake alat online StringDB. Ijo: Gen sing dipetakan menyang komponen seluler Ontologi Gen (GO): mitokondria (GO: 0005739). AKT1 minangka protein kanthi skor paling dhuwur (0,900) kanggo interaksi karo protein liyane adhedhasar data (adhedhasar penambangan teks, eksperimen, basis data, lan koekspresi). Simpul jaringan makili protein, lan pinggiran makili sambungan antarane protein.
Amarga metabolit mikrobiota usus bisa ngatur komposisi epigenetik liwat metilasi DNA [32], kita nyelidiki apa tingkat IPA serum ana gandhengane karo metilasi DNA ati. Kita nemokake manawa rong situs metilasi utama sing ana gandhengane karo tingkat IPA serum yaiku cedhak wilayah sugih prolin-serin 3 (C19orf55) lan protein kejut panas kulawarga B (cilik) anggota 6 (HSPB6) (File tambahan 3). Metilasi DNA 4350 CpG (p <0,01) berkorelasi karo tingkat IPA serum lan diperkaya ing jalur pangaturan umur dawa (p = 0,006) (Gambar 1A, Tabel 2, lan Gambar Tambahan 1C).
Kanggo mangerteni mekanisme biologis sing ndasari hubungan antarane tingkat IPA serum, transkrip global, transkrip sing ana gandhengane karo mitokondria, lan metilasi DNA ing ati manungsa, kita nindakake analisis tumpang tindih gen sing diidentifikasi ing analisis jalur sadurunge (Gambar 1A). Asil analisis pengayaan jalur saka 56 gen sing tumpang tindih (ing njero garis ireng ing Gambar 1A) nuduhake yen jalur apoptosis (p = 0,00029) nyoroti rong gen sing umum kanggo telung analisis: AKT1 lan YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), kaya sing dituduhake ing diagram Venn (Gambar Tambahan 2 lan Gambar 1A). Menariknya, kita nemokake yen AKT1 (cg19831386) lan YKT6 (cg24161647) berkorelasi positif karo tingkat IPA serum (File Tambahan 3). Kanggo ngenali interaksi protein potensial antarane produk gen, kita milih 13 gen kanthi skor wilayah umum paling dhuwur (0,900) ing antarane 56 gen sing tumpang tindih minangka input lan nggawe peta interaksi. Miturut tingkat kapercayan (kapercayan marginal), gen AKT1 kanthi skor paling dhuwur (0,900) ana ing ndhuwur (Gambar 1B).
Adhedhasar analisis jalur, kita nemokake yen apoptosis minangka jalur utama, mula kita nyelidiki apa perawatan IPA bakal mengaruhi apoptosis HSC in vitro. Sadurunge kita nduduhake yen dosis IPA sing beda (10 μM, 100 μM, lan 1 mM) ora beracun kanggo sel LX-2 [15]. Panliten iki nuduhake yen perawatan IPA ing 10 μM lan 100 μM nambah jumlah sel sing urip lan nekrotik. Nanging, dibandhingake karo klompok kontrol, kelangsungan urip sel mudhun ing konsentrasi IPA 1 mM, dene tingkat nekrosis sel tetep ora owah (Gambar 2A, B). Sabanjure, kanggo nemokake konsentrasi optimal kanggo ngindhuksi apoptosis ing sel LX-2, kita nguji 10 μM, 100 μM, lan 1 mM IPA sajrone 24 jam (Gambar 2A-E lan Gambar Tambahan 3A-B). Menariknya, IPA 10 μM lan 100 μM nyuda tingkat apoptosis (%), nanging, IPA 1 mM nambah apoptosis pungkasan lan tingkat apoptosis (%) dibandhingake karo kontrol lan mulane dipilih kanggo eksperimen luwih lanjut (Gambar 2A–D).
IPA ngindhuksi apoptosis sel LX-2. Metode pewarnaan ganda Annexin V lan 7-AAD digunakake kanggo ngukur tingkat apoptosis lan morfologi sel kanthi flow cytometry. Sel BA diinkubasi karo 10 μM, 100 μM lan 1 mM IPA sajrone 24 jam utawa karo F–H TGF-β1 (5 ng/ml) lan 1 mM IPA ing medium bebas serum sajrone 24 jam. A: sel urip (Annexin V -/ 7AAD-); B: sel nekrotik (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: awal (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: pungkasan (Annexin V+/7AAD.+); E, H: persentase total sel apoptosis awal lan pungkasan ing tingkat apoptosis (%). Data dinyatakake minangka rata-rata ± SD, n = 3 eksperimen independen. Perbandingan statistik ditindakake nggunakake ANOVA siji arah kanthi uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0.0001
Kaya sing wis dituduhake sadurunge, 5 ng/ml TGF-β1 bisa nyebabake aktivasi HSC kanthi nambah ekspresi gen penanda klasik [15]. Sel LX-2 diobati nganggo 5 ng/ml TGF-β1 lan 1 mM IPA kanthi kombinasi (Gambar 2E–H). Perawatan TGF-β1 ora ngowahi tingkat apoptosis, nanging, perawatan bebarengan IPA nambah apoptosis pungkasan lan tingkat apoptosis (%) dibandhingake karo perawatan TGF-β1 (Gambar 2E–H). Asil kasebut nuduhake yen 1 mM IPA bisa ningkatake apoptosis ing sel LX-2 kanthi ora gumantung saka induksi TGF-β1.
Kita luwih lanjut nyelidiki efek IPA marang respirasi mitokondria ing sel LX-2. Asil kasebut nuduhake yen 1 mM IPA nyuda parameter tingkat konsumsi oksigen (OCR): respirasi non-mitokondria, respirasi basal lan maksimal, kebocoran proton lan produksi ATP dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar 3A, B), dene indeks kesehatan bioenergetik (BHI) ora owah.
IPA nyuda respirasi mitokondria ing sel LX-2. Kurva respirasi mitokondria (OCR) ditampilake minangka parameter respirasi mitokondria (respirasi non-mitokondria, respirasi basal, respirasi maksimal, kebocoran proton, generasi ATP, SRC lan BHI). Sel A lan B diinkubasi karo 10 μM, 100 μM lan 1 mM IPA sajrone 24 jam. Sel C lan D diinkubasi karo TGF-β1 (5 ng/ml) lan 1 mM IPA ing medium bebas serum sajrone 24 jam. Kabeh pangukuran dinormalisasi menyang isi DNA nggunakake kit CyQuant. BHI: indeks kesehatan bioenergetik; SRC: kapasitas cadangan pernapasan; OCR: tingkat konsumsi oksigen. Data ditampilake minangka rata-rata ± deviasi standar (SD), n = 5 eksperimen independen. Perbandingan statistik ditindakake nggunakake ANOVA siji arah lan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; lan ***p < 0,001
Kanggo entuk pangerten sing luwih lengkap babagan efek IPA ing profil bioenergetik sel LX-2 sing diaktifake TGF-β1, kita nganalisa fosforilasi oksidatif mitokondria kanthi OCR (Gambar 3C, D). Asil kasebut nuduhake yen perawatan TGF-β1 bisa nyuda respirasi maksimal, kapasitas cadangan pernapasan (SRC) lan BHI dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar 3C, D). Kajaba iku, perawatan kombinasi nyuda respirasi basal, kebocoran proton lan produksi ATP, nanging SRC lan BHI luwih dhuwur tinimbang sing diobati nganggo TGF-β1 (Gambar 3C, D).
Kita uga nindakake "Tes Fenotipe Energi Seluler" sing diwenehake dening piranti lunak Seahorse (Gambar Tambahan 4A–D). Kaya sing dituduhake ing Gambar Tambahan 3B, potensial metabolik OCR lan ECAR mudhun sawise perawatan TGF-β1, nanging ora ana bedane sing diamati ing klompok perawatan kombinasi lan IPA dibandhingake karo klompok kontrol. Salajengipun, tingkat basal lan stres OCR mudhun sawise perawatan kombinasi lan IPA dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar Tambahan 4C). Menariknya, pola sing padha diamati karo terapi kombinasi, ing ngendi ora ana owah-owahan ing tingkat basal lan stres ECAR sing diamati dibandhingake karo perawatan TGF-β1 (Gambar Tambahan 4C). Ing HSC, pengurangan fosforilasi oksidatif mitokondria lan kemampuan perawatan kombinasi kanggo mulihake SCR lan BHI sawise paparan perawatan TGF-β1 ora ngowahi potensial metabolik (OCR lan ECAR). Dijupuk bebarengan, asil kasebut nuduhake yen IPA bisa nyuda bioenergetika ing HSC, sing nuduhake yen IPA bisa nyebabake profil energik sing luwih murah sing nggeser fenotipe HSC menyang inaktivasi (Gambar Tambahan 4D).
Efek IPA marang dinamika mitokondria diselidiki nggunakake kuantifikasi telung dimensi morfologi mitokondria lan sambungan jaringan uga pewarnaan MTR (Gambar 4 lan Gambar Tambahan 5). Gambar 4 nuduhake yen, dibandhingake karo klompok kontrol, perawatan TGF-β1 nyuda area permukaan rata-rata, jumlah cabang, dawa cabang total, lan jumlah sambungan cabang (Gambar 4A lan B) lan ngganti proporsi mitokondria saka morfologi bola dadi menengah (Gambar 4C). Mung perawatan IPA sing nyuda volume mitokondria rata-rata lan ngganti proporsi mitokondria saka morfologi bola dadi menengah dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar 4A). Kosok baline, sferisitas, dawa cabang rata-rata, lan aktivitas mitokondria sing ditaksir dening MTR sing gumantung potensial membran mitokondria (Gambar 4A lan E) tetep ora owah lan parameter kasebut ora beda antarane klompok. Dijupuk bebarengan, asil kasebut nuduhake yen perawatan TGF-β1 lan IPA katon ngowahi bentuk lan ukuran mitokondria uga kerumitan jaringan ing sel LX-2 sing urip.
IPA ngowahi dinamika mitokondria lan kelimpahan DNA mitokondria ing sel LX-2. A. Gambar confocal representatif saka sel LX-2 urip sing diinkubasi karo TGF-β1 (5 ng/ml) lan 1 mM IPA sajrone 24 jam ing medium bebas serum sing nuduhake jaringan mitokondria sing diwarnai karo Mitotracker™ Red CMXRos lan inti sing diwarnai biru karo DAPI. Kabeh data ngemot paling ora 15 gambar saben klompok. Kita entuk 10 gambar tumpukan-Z kanggo saben jinis sampel. Saben urutan sumbu-Z ngemot 30 irisan, saben kanthi kekandelan 9,86 μm. Bilah skala: 10 μm. B. Objek representatif (mitokondria mung) sing diidentifikasi kanthi ngetrapake ambang batas adaptif menyang gambar. Analisis kuantitatif lan perbandingan sambungan jaringan morfologis mitokondria ditindakake kanggo kabeh sel ing saben klompok. C. Frekuensi rasio bentuk mitokondria. Nilai sing cedhak karo 0 nuduhake bentuk bunder, lan nilai sing cedhak karo 1 nuduhake bentuk filamen. D Isi DNA mitokondria (mtDNA) ditemtokake kaya sing diterangake ing Bahan lan Metode. Analisis E Mitotracker™ Red CMXRos ditindakake kanthi flow cytometry (30.000 kedadeyan) kaya sing diterangake ing Materials and Methods. Data ditampilake minangka rata-rata ± SD, n = 3 eksperimen independen. Perbandingan statistik ditindakake nggunakake ANOVA siji arah lan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Banjur kita nganalisis isi mtDNA ing sel LX-2 minangka indikator jumlah mitokondria. Dibandhingake karo klompok kontrol, isi mtDNA tambah ing klompok sing diobati TGF-β1 (Gambar 4D). Dibandhingake karo klompok sing diobati TGF-β1, isi mtDNA mudhun ing klompok perawatan kombinasi (Gambar 4D), sing nuduhake yen IPA bisa nyuda isi mtDNA lan bisa uga jumlah mitokondria uga respirasi mitokondria (Gambar 3C). Kajaba iku, IPA katon nyuda isi mtDNA ing perawatan kombinasi nanging ora mengaruhi aktivitas mitokondria sing dimediasi MTR (Gambar 4A–C).
Kita nyelidiki hubungan IPA karo tingkat mRNA gen sing ana gandhengane karo fibrosis, apoptosis, kaslametan, lan dinamika mitokondria ing sel LX-2 (Gambar 5A–D). Dibandhingake karo klompok kontrol, klompok sing diobati TGF-β1 nuduhake peningkatan ekspresi gen kayata rantai α2 tipe I kolagen (COL1A2), aktin otot polos α (αSMA), matriks metalloproteinase 2 (MMP2), inhibitor jaringan metalloproteinase 1 (TIMP1), lan gen kaya dynamin 1 (DRP1), sing nuduhake peningkatan fibrosis lan aktivasi. Salajengipun, dibandhingake karo klompok kontrol, perawatan TGF-β1 nyuda tingkat mRNA reseptor pregnane X nuklir (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor sel B α, penambah peptida cahya gen faktor nuklir κ (NFκB1A), lan inhibitor subunit kinase faktor nuklir κB β (IKBKB) (Gambar 5A–D). Dibandhingake karo perawatan TGF-β1, perawatan kombinasi karo TGF-β1 lan IPA nyuda ekspresi COL1A2 lan MMP2, nanging nambah tingkat mRNA PXR, TIMP1, limfoma sel-B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, lan IKBKB. Perawatan IPA nyuda ekspresi MMP2, protein X sing ana gandhengane karo Bcl-2 (BAX), AKT1, protein atrofi optik 1 (OPA1), lan protein fusi mitokondria 2 (MFN2) kanthi signifikan, dene ekspresi CASP8, NFκB1A, NFκB1B, lan IKBKB tambah dibandhingake karo klompok kontrol. Nanging, ora ana bedane sing ditemokake ing ekspresi caspase-3 (CASP3), faktor pengaktif peptidase apoptotik 1 (APAF1), protein fusi mitokondria 1 (MFN1), lan protein fisi 1 (FIS1). Sacara kolektif, asil iki nuduhake yen perawatan IPA ngmodulasi ekspresi gen sing ana gandhengane karo fibrosis, apoptosis, kaslametan, lan dinamika mitokondria. Data kita nuduhake yen perawatan IPA nyuda fibrosis ing sel LX-2; ing wektu sing padha, iki ngrangsang kaslametan kanthi mindhah fenotipe menyang inaktivasi.
IPA ngmodulasi ekspresi gen fibroblas, apoptosis, viabilitas, lan dinamika mitokondria ing sel LX-2. Histogram nampilake ekspresi mRNA relatif marang kontrol endogen (RPLP0 utawa PPIA) sawise sel LX-2 diinduksi karo TGF-β1 lan IPA ing medium bebas serum sajrone 24 jam. A nuduhake fibroblas, B nuduhake sel apoptosis, C nuduhake sel sing isih urip, lan D nuduhake ekspresi gen dinamika mitokondria. Data ditampilake minangka rata-rata ± deviasi standar (SD), n = 3 eksperimen independen. Perbandingan statistik ditindakake nggunakake ANOVA siji arah lan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Banjur, owah-owahan ukuran sel (FSC-H) lan kompleksitas sitoplasma (SSC-H) ditaksir nganggo flow cytometry (Gambar 6A, B), lan owah-owahan morfologi sel sawise perawatan IPA ditaksir nganggo mikroskop elektron transmisi (TEM) lan mikroskop kontras fase (Gambar Tambahan 6A-B). Kaya sing dikarepake, sel ing klompok sing diobati TGF-β1 nambah ukurane dibandhingake karo klompok kontrol (Gambar 6A, B), nuduhake ekspansi klasik retikulum endoplasma kasar (ER*) lan fagolisosom (P), sing nuduhake aktivasi sel punca hematopoietik (HSC) (Gambar Tambahan 6A). Nanging, dibandhingake karo klompok sing diobati TGF-β1, ukuran sel, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A, B), lan isi ER* mudhun ing klompok perawatan kombinasi TGF-β1 lan IPA (Gambar Tambahan 6A). Salajengipun, perawatan IPA nyuda ukuran sel, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A, B), isi P lan ER* (Gambar Tambahan 6A) dibandhingake karo klompok kontrol. Kajaba iku, isi sel apoptosis mundhak sawise 24 jam perawatan IPA dibandhingake karo klompok kontrol (panah putih, Gambar Tambahan 6B). Sacara kolektif, asil kasebut nuduhake yen 1 mM IPA bisa ngrangsang apoptosis HSC lan mbalikke owah-owahan ing parameter morfologi sel sing disebabake dening TGF-β1, saengga ngatur ukuran lan kerumitan sel, sing bisa uga ana gandhengane karo inaktivasi HSC.
IPA ngowahi ukuran sel lan kompleksitas sitoplasma ing sel LX-2. Gambar representatif saka analisis sitometri aliran. Analisis kasebut nggunakake strategi gating khusus kanggo sel LX-2: SSC-A/FSC-A kanggo nemtokake populasi sel, FSC-H/FSC-A kanggo ngenali doublet, lan SSC-H/FSC-H kanggo analisis ukuran lan kompleksitas sel. Sel diinkubasi karo TGF-β1 (5 ng/ml) lan 1 mM IPA ing medium bebas serum sajrone 24 jam. Sel LX-2 disebarake ing kuadran kiwa ngisor (SSC-H-/FSC-H-), kuadran kiwa ndhuwur (SSC-H+/FSC-H-), kuadran tengen ngisor (SSC-H-/FSC-H+), lan kuadran tengen ndhuwur (SSC-H+/FSC-H+) kanggo analisis ukuran sel lan kompleksitas sitoplasma. B. Morfologi sel dianalisis kanthi sitometri aliran nggunakake FSC-H (sebaran maju, ukuran sel) lan SSC-H (sebaran sisih, kompleksitas sitoplasma) (30.000 kedadeyan). Data ditampilake minangka rata-rata ± SD, n = 3 eksperimen independen. Perbandingan statistik ditindakake nggunakake ANOVA siji arah lan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 lan ****p < 0,0001
Metabolit usus kaya ta IPA wis dadi topik riset sing rame, sing nuduhake yen target anyar bisa ditemokake ing mikrobiota usus. Mula, menarik yen IPA, metabolit sing wis dihubungake karo fibrosis ati ing manungsa [15], wis dituduhake minangka senyawa anti-fibrotik potensial ing model kewan [13, 14]. Ing kene, kita nduduhake kanggo pisanan hubungan antarane IPA serum lan transkriptomik ati global lan metilasi DNA ing individu obesitas tanpa diabetes tipe 2 (T2D), sing nyoroti apoptosis, mitofagi lan umur dawa, uga kemungkinan gen kandidat AKT1 sing ngatur homeostasis ati. Liyane sing anyar saka panliten kita yaiku kita nduduhake interaksi perawatan IPA karo apoptosis, morfologi sel, bioenergetika mitokondria lan dinamika ing sel LX-2, sing nuduhake spektrum energi sing luwih murah sing ngowahi fenotipe HSC menyang inaktivasi, nggawe IPA dadi kandidat potensial kanggo ningkatake fibrosis ati.
Kita nemokake manawa apoptosis, mitofagi, lan umur dawa minangka jalur kanonik sing paling penting sing diperkaya ing gen ati sing ana gandhengane karo IPA serum sing sirkulasi. Gangguan sistem kontrol kualitas mitokondria (MQC) bisa nyebabake disfungsi mitokondria, mitofagi, lan apoptosis, saengga ningkatake kedadeyan MASLD [33, 34]. Mulane, kita bisa berspekulasi manawa IPA bisa uga melu njaga dinamika sel lan integritas mitokondria liwat apoptosis, mitofagi, lan umur dawa ing ati. Data kita nuduhake manawa rong gen umum ing telung uji coba: YKT6 lan AKT1. Perlu dicathet manawa YKT6 minangka protein SNARE sing melu proses fusi membran sel. Iki nduweni peran ing autofagi lan mitofagi kanthi mbentuk kompleks inisiasi karo STX17 lan SNAP29 ing autofagosom, saengga ningkatake fusi autofagosom lan lisosom [35]. Salajengipun, ilang fungsi YKT6 nyebabake gangguan mitofagi [36], dene upregulasi YKT6 ana gandhengane karo perkembangan karsinoma hepatoseluler (HCC), sing nuduhake peningkatan kelangsungan urip sel [37]. Ing sisih liya, AKT1 minangka gen sing paling penting sing berinteraksi lan nduweni peran penting ing penyakit ati, kalebu jalur sinyal PI3K/AKT, siklus sel, migrasi sel, proliferasi, adhesi fokal, fungsi mitokondria, lan sekresi kolagen [38–40]. Jalur sinyal PI3K/AKT sing diaktifake bisa ngaktifake sel punca hematopoietik (HSC), yaiku sel sing tanggung jawab kanggo produksi matriks ekstraseluler (ECM), lan disregulasi kasebut bisa nyumbang kanggo kedadeyan lan perkembangan fibrosis ati [40]. Kajaba iku, AKT minangka salah sawijining faktor kunci kanggo kaslametané sel sing nyegah apoptosis sel sing gumantung p53, lan aktivasi AKT bisa uga ana gandhengane karo inhibisi apoptosis sel ati [41, 42]. Asil sing dipikolehi nuduhake yen IPA bisa uga melu apoptosis sing ana gandhengane karo mitokondria ati kanthi mengaruhi keputusan hepatosit antarane mlebu apoptosis utawa kaslametané. Efek kasebut bisa diatur dening gen kandidat AKT lan/utawa YKT6, sing penting kanggo homeostasis ati.
Asil panaliten nuduhake yen 1 mM IPA nyebabake apoptosis lan nyuda respirasi mitokondria ing sel LX-2 tanpa perawatan TGF-β1. Perlu dicathet yen apoptosis minangka jalur utama kanggo resolusi fibrosis lan aktivasi sel punca hematopoietik (HSC), lan uga minangka acara kunci ing respon fisiologis fibrosis ati sing bisa dibalikke [4, 43]. Kajaba iku, pemulihan BHI ing sel LX-2 sawise perawatan kombinasi menehi wawasan anyar babagan peran potensial IPA ing regulasi bioenergetika mitokondria. Ing kahanan istirahat lan ora aktif, sel hematopoietik biasane nggunakake fosforilasi oksidatif mitokondria kanggo ngasilake ATP lan duwe aktivitas metabolisme sing kurang. Ing sisih liya, aktivasi HSC nambah respirasi lan biosintesis mitokondria kanggo ngimbangi kabutuhan energi kanggo mlebu ing kahanan glikolitik [44]. Kasunyatan manawa IPA ora mengaruhi potensial metabolisme lan ECAR nuduhake yen jalur glikolitik kurang diprioritasake. Kajaba iku, panliten liyane nuduhake yen 1 mM IPA bisa modulasi aktivitas rantai pernapasan mitokondria ing kardiomiosit, garis sel hepatosit manungsa (Huh7) lan sel endotel vena umbilikalis manungsa (HUVEC); Nanging, ora ana efek IPA sing ditemokake ing glikolisis ing kardiomiosit, sing nuduhake yen IPA bisa mengaruhi bioenergetika jinis sel liyane [45]. Mulane, kita berspekulasi yen 1 mM IPA bisa tumindak minangka uncoupler kimia entheng, amarga bisa nyuda ekspresi gen fibrogenik, morfologi sel lan bioenergetika mitokondria kanthi signifikan tanpa ngganti jumlah mtDNA [46]. Uncoupler mitokondria bisa nyegah fibrosis sing diinduksi kultur lan aktivasi HSC [47] lan nyuda produksi ATP mitokondria sing diatur utawa diinduksi dening protein tartamtu kayata protein uncoupling (UCP) utawa adenin nukleotida translocase (ANT). Gumantung saka jinis sel, fenomena iki bisa nglindhungi sel saka apoptosis lan/utawa ningkatake apoptosis [46]. Nanging, panliten luwih lanjut dibutuhake kanggo njlentrehake peran IPA minangka uncoupler mitokondria ing inaktivasi sel punca hematopoietik.
Banjur kita nyelidiki apa owah-owahan ing respirasi mitokondria katon ing morfologi mitokondria ing sel LX-2 sing urip. Menariknya, perawatan TGF-β1 ngowahi proporsi mitokondria saka sferis dadi menengah, kanthi penurunan percabangan mitokondria lan peningkatan ekspresi DRP1, faktor kunci ing fisi mitokondria [48]. Salajengipun, fragmentasi mitokondria digandhengake karo kerumitan jaringan sakabèhé, lan transisi saka fusi menyang fisi penting banget kanggo aktivasi sel punca hematopoietik (HSC), dene inhibisi fisi mitokondria nyebabake apoptosis HSC [49]. Mangkono, asil kita nuduhake yen perawatan TGF-β1 bisa nyebabake penurunan kompleksitas jaringan mitokondria kanthi penurunan percabangan, sing luwih umum ing fisi mitokondria sing digandhengake karo sel punca hematopoietik (HSC) sing diaktifake. Salajengipun, data kita nuduhake yen IPA bisa ngganti proporsi mitokondria saka bentuk sferis dadi menengah, saengga nyuda ekspresi OPA1 lan MFN2. Panliten nuduhake yen downregulation OPA1 bisa nyebabake penurunan potensial membran mitokondria lan micu apoptosis sel [50]. MFN2 dikenal minangka mediator fusi mitokondria lan apoptosis [51]. Asil sing dipikolehi nuduhake yen induksi sel LX-2 dening TGF-β1 lan/utawa IPA katon bisa ngowahi bentuk lan ukuran mitokondria, uga kahanan aktivasi lan kerumitan jaringan.
Asil panaliten nuduhake yen perawatan kombinasi TGFβ-1 lan IPA bisa nyuda mtDNA lan parameter morfologi sel kanthi ngatur ekspresi mRNA fibrosis, apoptosis, lan gen sing ana gandhengane karo kaslametan ing sel sing ngindhari apoptosis. Pancen, IPA nyuda tingkat ekspresi mRNA AKT1 lan gen fibrosis penting kayata COL1A2 lan MMP2, nanging nambah tingkat ekspresi CASP8, sing ana gandhengane karo apoptosis. Asil panaliten nuduhake yen sawise perawatan IPA, ekspresi BAX mudhun lan ekspresi mRNA subunit kulawarga TIMP1, BCL-2 lan NF-κB mundhak, sing nuduhake yen IPA bisa ngrangsang sinyal kaslametan ing sel punca hematopoietik (HSC) sing ngindhari apoptosis. Molekul-molekul iki bisa tumindak minangka sinyal pro-kaslametan ing sel punca hematopoietik sing diaktifake, sing bisa uga ana gandhengane karo tambah ekspresi protein anti-apoptosis (kayata Bcl-2), mudhun ekspresi BAX pro-apoptosis, lan interaksi kompleks antarane TIMP lan NF-κB [5, 7]. IPA ngetokake efek liwat PXR, lan kita nemokake manawa perawatan kombinasi karo TGF-β1 lan IPA nambah tingkat ekspresi mRNA PXR, sing nuduhake penekanan aktivasi HSC. Sinyal PXR sing diaktifake dikenal bisa nyegah aktivasi HSC in vivo lan in vitro [52, 53]. Asil kita nuduhake manawa IPA bisa melu ngresiki HSC sing diaktifake kanthi ningkatake apoptosis, nyuda metabolisme fibrosis lan mitokondria, lan nambah sinyal kaslametan, sing minangka proses khas sing ngowahi fenotipe HSC sing diaktifake dadi sing ora diaktifake. Panjelasan liyane sing bisa ditindakake kanggo mekanisme potensial lan peran IPA ing apoptosis yaiku ngresiki mitokondria sing ora berfungsi utamane liwat mitofagi (jalur intrinsik) lan jalur sinyal TNF ekstrinsik (Tabel 1), sing langsung ana gandhengane karo jalur sinyal kaslametan NF-κB (Gambar Tambahan 7). Menarik, gen sing diperkaya sing ana gandhengane karo IPA bisa nyebabake sinyal pro-apoptosis lan pro-kaslametan ing jalur apoptosis [54], sing nuduhake manawa IPA bisa nyebabake jalur apoptosis utawa kaslametan kanthi sesambungan karo gen kasebut. Nanging, kepiye IPA nyebabake apoptosis utawa kaslametan sajrone aktivasi HSC lan jalur mekanistik isih durung jelas.
IPA iku metabolit mikroba sing kawangun saka triptofan panganan liwat mikrobiota usus. Panliten nuduhake yen IPA nduweni sipat anti-inflamasi, antioksidan, lan epigenetik ing lingkungan usus.[55] Panliten nuduhake yen IPA bisa modulasi fungsi alangan usus lan nyuda stres oksidatif, sing bisa nyumbang kanggo efek fisiologis lokal.[56] Nyatane, IPA diangkut menyang organ target liwat sirkulasi, lan amarga IPA nuduhake struktur metabolit utama sing padha karo triptofan, serotonin, lan turunan indol, IPA nindakake tumindak metabolisme sing nyebabake nasib metabolisme sing kompetitif.[52] IPA bisa saingan karo metabolit sing asale saka triptofan kanggo situs pengikatan ing enzim utawa reseptor, sing bisa ngganggu jalur metabolisme normal. Iki nyoroti kabutuhan kanggo panliten luwih lanjut babagan farmakokinetik lan farmakodinamik kanggo luwih ngerti jendela terapeutik.[57] Isih kudu dideleng apa iki uga bisa kedadeyan ing sel punca hematopoietik (HSC).
Kita ngakoni manawa panliten kita nduweni sawetara watesan. Kanggo nliti kanthi khusus hubungan sing ana gandhengane karo IPA, kita ora kalebu pasien diabetes mellitus tipe 2 (T2DM). Kita ngakoni manawa iki mbatesi aplikasi sing jembar saka temuan kita kanggo pasien diabetes mellitus tipe 2 lan penyakit ati lanjut. Sanajan konsentrasi fisiologis IPA ing serum manungsa yaiku 1-10 μM [11, 20], konsentrasi 1 mM IPA dipilih adhedhasar konsentrasi non-toksik paling dhuwur [15] lan tingkat apoptosis paling dhuwur, tanpa bedane persentase populasi sel nekrotik. Sanajan tingkat suprafisiologis IPA digunakake ing panliten iki, saiki ora ana konsensus babagan dosis efektif IPA [52]. Sanajan asil kita signifikan, nasib metabolisme IPA sing luwih jembar tetep dadi area riset sing aktif. Kajaba iku, temuan kita babagan hubungan antarane tingkat serum IPA lan metilasi DNA transkrip ati dipikolehi ora mung saka sel punca hematopoietik (HSC) nanging uga saka jaringan ati. Kita milih nggunakake sel LX-2 manungsa adhedhasar temuan sadurunge saka analisis transkriptom yen IPA ana gandhengane karo aktivasi sel punca hematopoietik (HSC) [15], lan HSC minangka sel utama sing melu perkembangan fibrosis ati. Ati kasusun saka pirang-pirang jinis sel, mula model sel liyane kayata sistem ko-kultur sel hepatosit-HSC-imun sing digabungake karo aktivasi caspase lan fragmentasi DNA uga mekanisme aksi kalebu tingkat protein kudu ditimbang kanggo nyinaoni peran IPA lan interaksine karo jinis sel ati liyane.