Pemilahan protein ing jalur sekretori iku penting kanggo njaga kompartementalisasi lan homeostasis sel. Saliyane pemilahan sing dimediasi cangkang, peran lipid ing pemilahan kinesin ing proses transportasi sekretori minangka pitakonan dhasar sing wis suwe durung dijawab. Ing kene, kita nindakake pencitraan wektu nyata resolusi dhuwur multiwarna simultan 3D kanggo mbuktekake in vivo yen protein glikosilfosfatidilinositol sing mentas disintesis kanthi gugus lipid seramida sing dawa banget dikelompokake lan diklasifikasikake dadi situs metu endoplasma khusus, sing beda karo sing digunakake dening protein transmembran. Kajaba iku, kita nuduhake yen dawa rantai seramida ing membran retikulum endoplasma penting banget kanggo selektivitas pemilahan iki. Panliten kita nyedhiyakake bukti in vivo langsung pisanan kanggo nglasifikasikake kargo protein adhedhasar dawa rantai lipid dadi situs ekspor selektif ing jalur sekretori.
Ing sel eukariotik, protein sing disintesis ing retikulum endoplasma (ER) banjur diurutake sajrone transportasi liwat jalur sekretori kanggo dikirim menyang tujuan seluler sing cocog (1). Saliyane pemilahan sing dimediasi lapisan, wis suwe dispekulasikake manawa lipid tartamtu uga bisa dadi titik metu selektif kanthi nglompokake menyang domain membran tartamtu sing protein tartamtu (2-5). Nanging, isih ana kekurangan bukti langsung in vivo kanggo mbuktekake mekanisme adhedhasar lipid iki. Kanggo ngatasi masalah dhasar iki, kita nyinaoni ing ragi kepiye protein jangkar glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) diekspor kanthi beda saka ER. GPI-AP minangka macem-macem protein permukaan sel sing disambungake karo lipid (6, 7). GPI-AP minangka protein sing disekresi sing dipasang ing leaflet njaba membran plasma liwat gugus glikolipid (jangkar GPI). Dheweke nampa jangkar GPI minangka modifikasi pasca-translasi konservatif ing lumen ER (8). Sawise nempel, GPI-AP ngliwati aparatus Golgi (5, 9) saka ER menyang membran plasma. Anane jangkar GPI nyebabake GPI-AP diangkut kanthi kapisah saka protein sing disekresi transmembran (kalebu protein membran plasma liyane) ing sadawane jalur sekretori (5, 9, 10). Ing sel ragi, GPI-AP dipisahake saka protein sing disekresi liyane ing retikulum endoplasma, banjur dikemas dadi vesikel unik sing dibungkus dening kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi iki ing proses ekspor ER durung jelas, nanging dispekulasikake yen mekanisme iki mbutuhake lipid, utamane remodeling struktural bagean lipid saka jangkar GPI (5, 8). Ing ragi, remodeling lipid GPI diwiwiti langsung sawise GPI nempel, lan ing pirang-pirang kasus, nyebabake seramida kaiket karo asam lemak jenuh rantai panjang 26-karbon (C26:0) (11, 12). Seramida C26 minangka seramida utama sing diasilake dening sel ragi nganti saiki. Seramida iki disintesis ing ER lan umume diekspor menyang aparatus Golgi liwat vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP khusus mbutuhake sintesis seramida sing terus-terusan (14, 15), lan sabanjure, konversi seramida dadi seramida inositol fosfat (IPC) ing aparatus Golgi gumantung marang sintesis jangkar GPI (16). Panliten biofisika nganggo membran buatan nuduhake yen seramida rantai asil sing dawa banget bisa nyawiji kanggo mbentuk domain sing teratur kanthi sifat fisik sing unik (17, 18). Data kasebut ndadékaké hipotesis yen seramida C26 lan GPI-AP karo seramida C26 nggunakake sifat fisik kanggo nyawiji dadi wilayah utawa wilayah sing teratur ing lingkungan lipid membran ER sing relatif semrawut. Iki utamane kasusun saka gliserolipid cendhak lan ora jenuh (C16:1 lan C18:1) (19, 20). Wilayah-wilayah iki bakal difokusake kanthi selektif ing situs metu ER (ERES) tartamtu, ing ngendi seramida lan GPI-AP berbasis seramida bisa diangkut bebarengan menyang Golgi ing vesikel COPII khusus sing padha (5).
Ing panliten iki, kita wis nguji langsung mekanisme berbasis lipid iki kanthi nggunakake mikroskop pencitraan wektu nyata confocal super-resolusi (SCLIM), yaiku teknik mikroskopi canggih sing bisa mirsani protein sing diwenehi label fluoresensi kanthi bebarengan. Gambar telung warna lan telung dimensi (3D) nduweni resolusi lan kecepatan sing dhuwur banget ing sel urip (21, 22).
Kita pisanan ngetrapake teknologi SCLIM kanggo nemtokake luwih lanjut kepiye GPI-AP normal karo klompok ceramide C26 disaring saka protein sing disekresi transmembran sawise ninggalake ER ing S. cerevisiae. Kanggo mriksa klasifikasi ER, kita nggunakake sistem genetik sing bisa langsung nggambarake kargo sing nembe disintesis mlebu ERES in vivo (7, 23). Minangka kargo, kita milih GPI-AP Gas1 berbasis ceramide C26 sing diwenehi label protein fluoresen ijo (GFP) lan protein sing disekresi transmembran Mid2 diwenehi label protein fluoresen inframerah cedhak (iRFP), loro-lorone nargetake membran plasma (24-26). Ing mutan sensitif suhu sec31-1, loro kargo iki diekspresikan ing sangisore promotor sing bisa diinduksi galaktosa lan penanda ERES konstitutif. Ing suhu ekstrem (37°C), amarga mutasi sec31-1 mengaruhi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 kanggo nyegah perkecambahan COPII lan ekspor ER, kargo sing nembe disintesis nglumpuk ing ER (23). Sawise adhem nganti suhu endhek (24°C), sel mutan sec31-1 pulih saka area sekretori, lan kargo sintetik anyar sing akumulasi wiwit diekspor saka UGD. Visualisasi CLIM nuduhake yen umume Gas1-GFP lan Mid2-iRFP sing mentas disintesis isih nglumpuk ing UGD sel mutan sec31-1 sawise inkubasi ing suhu 37°C banjur dirilis ing suhu 24°C sajrone 5 menit (Gambar 1). Amarga Mid2-iRFP disebar ing kabeh membran ER, lan Gas1-GFP dikonsentrasi lan dikumpulake ing area membran ER sing ora kontinyu, distribusine beda banget (Gambar 1, A nganti C lan Film S1). Kajaba iku, kaya sing dituduhake ing Gambar 1D, kluster Gas1-GFP ora duwe Mid2-iRFP. Asil kasebut nuduhake yen GPI-AP lan protein transmembran dipisahake dadi wilayah membran ER sing beda-beda wiwit awal. Gugus Gas1-GFP jejer karo ERES tartamtu sing diwenehi label protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E lan F, lan film S1) (23).
Sel sec31-1 ngekspresikake sekresi sing diinduksi galaktosa, seramida rantai asil dawa (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) lan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) lan label ERES Konstruktif Sec13-mCherry (ERES, magenta) iki diinkubasi ing suhu 37°C sajrone 30 menit, dipindhah menyang 24°C, lan dicitrakake dening SCLIM 5 menit sabanjure. (A nganti C) nuduhake gambar 2D gabungan utawa tunggal sing representatif saka bidang (A), gambar proyeksi 2D saka 10 bagean-z (B) utawa gambar belahan sel 3D saka kargo lan penanda ERES (C). Bilah skala 1μm (A lan B). Unit skala yaiku 0,551μm (C). Gas1-GFP dideteksi ing wilayah utawa kluster ER sing diskrit, dene Mid2-iRFP dideteksi lan disebar ing saindenging membran ER (C). (D) Grafik iki nuduhake intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP lan Mid2-iRFP ing kluster Gas1-GFP ing sadawane garis panah putih (kiwa). AU, unit sembarang. (E lan F) makili gambar 3D sing nggabungake barang lan tandha ERES. Kluster Gas1-GFP dideteksi cedhak ERES tartamtu. Unit skala yaiku 0,551μm. (F) Panah putih padat nandhani kluster Gas1-GFP sing ana gandhengane karo ERES. Panel tengah lan tengen nuduhake gambar 3D sing digedhekake lan tampilan sing diputer saka kluster Gas1-GFP sing dipilih.
Hubungan spasial sing raket antarane kluster Gas1-GFP lan ERES tartamtu nuduhake yen Gas1-GFP bisa mlebu ERES selektif, sing beda karo selektivitas sing digunakake dening Mid2-iRFP kanggo ninggalake ER. Kanggo ngatasi kemungkinan iki, kita ngetung rasio ERES mung kanggo siji utawa rong barang (Gambar 2, A nganti C). Kita nemokake yen umume ERES (70%) mung ngemot siji jinis kargo. Gambar ngisor Gambar 2C nuduhake rong conto khas ERES mung nganggo Gas1-GFP (Gambar 1) utawa mung Mid2-iRFP (Gambar 2). Kosok baline, kira-kira 20% ERES ngemot rong kargo sing tumpang tindih ing wilayah sing padha. Ditemokake yen sawetara ERES (10%) ngemot rong jinis kargo, nanging diisolasi ing wilayah sing beda banget. Mulane, analisis statistik iki nuduhake yen sawise ER diekspor, GPI-AP Gas1-GFP lan kargo transmembran Mid2-iRFP dipérang dadi ERES sing beda (Gambar 2D). Efisiensi pamilahan iki konsisten banget karo analisis biokimia sadurunge (6) lan panentu morfologis (7). Kita uga bisa mirsani prilaku kargo sing dikarantina mlebu ERES (Gambar 2E lan Film S2). Gambar 2E nuduhake yen mung bagean cilik saka Gas1-GFP (panel 3) utawa Mid2-iRFP (panel 4) sing mlebu ERES saka sisih siji lan diwatesi ing area sing diskrit. Panel 5 saka Gambar 2E nuduhake yen Gas1-GFP lan Mid2-iRFP kadhangkala ditemokake ing ERES sing padha, nanging mlebu saka sisih sing beda lan dikonsentrasi ing wilayah sing kapisah sing bisa makili vesikel COPII sing beda. Kita uga ngonfirmasi yen pamisahan lan klasifikasi Gas1 GPI-AP adhedhasar ceramide C26 minangka ERES selektif sing diamati spesifik amarga kargo sekresi transmembran liyane, protein membran plasma sing ditandai GFP Axl2 (27), nuduhake prilaku sing padha karo Mid2-iRFP. (Gambar S1 lan Film S3). Axl2-GFP sing mentas disintesis disebar liwat membran ER kaya Mid2-iRFP (Gambar S1, A lan B), lan dilokalisasi bebarengan karo Mid2-iRFP ing umume ERES (Gambar S1, B nganti D). Panel 1 lan 2 saka Gambar 1. S1C nuduhake rong conto khas ERES ing ngendi rong kargo transmembran tumpang tindih. Ing kasus iki, loro barang mlebu ERES bebarengan (Gambar S1E, Panel 3 lan Film S3).
Sel sec31-1 sing ngekspresikake sekresi sing bisa diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) lan Mid2-iRFP (TMP, biru) lan label ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) diselehake ing suhu 37°C. Sawise diinkubasi sajrone 30 menit ing suhu °C, pindhah menyang 24°C kanggo ngeculake blok sekresi, lan gambar nganggo SCLIM sawise 20 menit. (A nganti C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; bar skala, 1μm) utawa gambar belahan sel 3D (B lan C; unit skala, 0,456μm) saka kargo lan 10 bagean-z sing ditandhani dening ERES. Panel ngisor ing (B) lan panel ing (C) nampilake gambar sing diproses kanggo mung nampilake barang sing ana ing ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) lan Mid2-iRFP (biru enom)]. (C) Panah mbukak: ERES mung nggawa siji kargo (1 nganti 4). Panah abu-abu: ERES ngemot kargo sing dipisahake (5). Panah putih pekat: ERES ngemot kargo sing ana ing lokasi sing padha. Ing ngisor iki: ERES tunggal sing dipilih mung ngemot Gas1-GFP (1) utawa Mid2-iRFP (2). Bilah skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf sing diterangake ing (C). Persentase rata-rata ERES sing mung ngemot siji kargo (Gas1-GFP utawa Mid2-iRFP), kargo sing dipisahake lan kargo sing tumpang tindih. Ing telung eksperimen independen, n=432 ing 54 sel. Bilah kesalahan = SD. Uji t rong sisi sing ora dipasangake. *** P = 0,0002. (E) Gambar 3D saka ERES sing dipilih saka kargo karantina sing ditandhani nganggo (C). Gas1-GFP (ijo) (3) utawa Mid2-iRFP (biru) (4) mlebu ERES (magenta) saka sisih siji lan diwatesi ing area cilik ing ERES. Kadhangkala, loro jinis kargo mlebu ERES sing padha (5) saka sisih sing padha lan diwatesi ing area sing terisolasi ing njero ERES. Skala bar, 100 nm.
Sabanjure, kita nguji hipotesis yen ceramide rantai asil dawa (C26) sing ana ing membran ER ndorong kluster lan pamilahan Gas1 sing spesifik dadi ERES selektif. Kanggo tujuan iki, kita nggunakake galur ragi sing dimodifikasi GhLag1, ing ngendi rong sintase ceramide endogen Lag1 lan Lac1 diganti karo GhLag1 (homolog kapas Lag1), sing nyebabake galur ragi kanthi membran sel galur Ceramide sing luwih cendhek tinimbang tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spektrometri massa (MS) nuduhake yen ing galur tipe liar, 95% saka total ceramide yaiku ceramide rantai sing dawa banget (C26), dene ing GhLag1, 85% saka ceramide sing dawa banget (C18 lan C16). ), mung 2% saka ceramide sing minangka ceramide rantai sing dawa banget (C26). Sanajan seramida C18 lan C16 minangka seramida utama sing dideteksi ing membran GhLag1 nganti saiki, analisis MS uga ngonfirmasi manawa jangkar GPI Gas1-GFP sing diekspresikan ing galur GhLag1 ngandhut seramida C26, sing bisa dibandhingake karo lipid tipe liar. Kualitas kasebut padha (Gambar 3A) (26). Mulane, iki tegese enzim remodeling seramida Cwh43 selektif banget kanggo seramida C26, kaya sing dituduhake ing Gambar 26, luwih seneng nggabungake jangkar GPI saka jumlah cilik seramida C26 ing galur GhLag1. S2 (29). Nanging, membran sel GhLag1 mung ngandhut seramida C18-C16, dene Gas1-GFP isih duwe seramida C26. Kasunyatan iki ndadekake galur iki minangka alat sing ideal kanggo ngatasi masalah dawa rantai asil seramida membran ing ER. Peran hipotetis kelas lan sortir. Banjur, kita pisanan nyinaoni kemampuan C26 Gas1-GFP kanggo nglumpuk ing kluster ing GhLag1 kanthi alel mutan sensitif suhu sec31-1 liwat mikroskop fluoresensi konvensional, ing ngendi mung rantai dawa (C18-C16) sing ana ing membran ER Ceramide (Gambar 3). Kita mirsani manawa ing sec31-1, umume Gas1-GFP dikonsentrasi ing kluster, dene Gas1-GFP ing sec31-1 GhLag1 kanthi membran ER ceramide dawa (C18-C16) utamane ora dikluster lan disebar ing kabeh membran ER. Kanggo luwih tepat, amarga kluster adhedhasar ceramide C26 raket banget karo ERES tartamtu (Gambar 1), kita sabanjure nyelidiki apa proses iki uga bisa nglibatake fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP nggunakake sistem COPII khusus kanggo ekspor ER, sing diatur kanthi aktif dening remodeling struktural Ted1 saka bagean glikan saka jangkar GPI (30, 31). GPI-glycan rekombinan banjur dikenali dening kompleks reseptor kargo transmembran p24, sing banjur milih Lst1, yaiku isoform spesifik saka subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, mbentuk Vesikel COPII sing sugih GPI-AP dibutuhake (31-33). Mulane, kita nggawe mutan ganda sing nggabungake delesi protein tunggal iki (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glycan Ted1 lan subunit COPII spesifik Lst1) karo galur mutan sec31-1, lan nyinaoni Apa bisa mbentuk Gas1-cluster GFP (Gambar 3). Kita mirsani manawa ing sec31-1emp24Δ lan sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP utamane ora dikluster lan disebar ing saindenging membran ER, kaya sing katon sadurunge ing sec31-1 GhLag1, dene ing sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Kaya sec31-1. Asil kasebut nuduhake yen saliyane anane seramida C26 ing membran ER, kluster Gas1-GFP uga kudu kaiket karo kompleks p24, lan ora mbutuhake rekrutmen Lst1 tartamtu. Banjur, kita njelajah kemungkinan yen dawa rantai seramida ing membran ER bisa ngatur pengikatan Gas1-GFP menyang p24. Nanging, kita nemokake yen anane seramida C18-C16 ing membran ora mengaruhi GPI-glikan sing direkonstruksi dening kompleks p24 (Gambar S3 lan S4, A lan B) utawa kaiket karo GPI-AP lan kemampuan ngekspor GPI-AP. Rekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Mulane, kluster sing gumantung karo seramida C26 ora mbutuhake interaksi protein karo mekanisme ekspor protein ER sing beda, nanging ndhukung mekanisme pemilahan alternatif sing didorong dening dawa lipid. Banjur, kita nganalisa apa dawa rantai seramida asil ing membran ER penting kanggo klasifikasi Gas1-GFP sing efektif minangka ERES selektif. Amarga Gas1 ing galur GhLag1 kanthi ceramide rantai cendhak ninggalake ER lan mlebu membran plasma (Gambar S5), kita percaya yen pamilahan didorong dening dawa rantai ceramide asil, Gas1 ing galur GhLag1 bisa dialihake lan disilangkan. Barang ERES kanthi membran sing padha.
(A) Membran sel GhLag1 utamane ngandhut ceramide C18-C16 sing luwih cendhek, dene jangkar GPI Gas1-GFP isih duwe IPC C26 sing padha karo sel tipe liar. Ing ndhuwur: analisis dawa rantai asil ceramide ing membran sel galur tipe liar (Wt) lan GhLag1p kanthi spektrometri massa (MS). Data kasebut nggambarake persentase total ceramide. Rata-rata saka telung eksperimen independen. Bilah kesalahan = SD. Uji t rong sisi sing ora dipasangake. **** P <0,0001. Panel ngisor: Analisis MS saka dawa rantai asil IPC sing ana ing jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) sing diekspresikan ing galur tipe liar lan GhLag1p. Data kasebut nggambarake persentase total sinyal IPC. Rata-rata saka limang eksperimen independen. Bilah kesalahan = SD. Uji t rong sisi sing ora dipasangake. ns, ora penting. P = 0,9134. (B) Mikrograf fluoresensi sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ lan sec31-1lst1Δ sing ngekspresikan Gas1-GFP sing diinduksi galaktosa diinkubasi ing suhu 37°C sajrone 30 menit lan diturunake menyang Nindakake mikroskop fluoresensi rutin sawise 24°C. Panah putih: Kluster ER Gas1-GFP. Panah mbukak: Gas1-GFP sing ora dikluster disebar ing kabeh membran ER, nuduhake pewarnaan cincin nuklir karakteristik ER. Bilah skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf sing diterangake ing (B). Persentase rata-rata sel kanthi struktur Gas1-GFP sing belang-belang. Ing telung eksperimen independen, n≥300 sel. Bilah kesalahan = SD. Uji t rong sisi sing ora dipasangake. **** P <0.0001.
Kanggo ngatasi masalah iki kanthi langsung, kita nindakake visualisasi SCLIM saka Gas1-GFP lan Mid2-iRFP ing GhLag1 kanthi alel mutan sensitif suhu sec31-1 (Gambar 4 lan Film S4). Sawise ER ditahan ing suhu 37°C lan banjur dirilis ing suhu 24°C, umume Gas1-GFP sing mentas disintesis ora dikelompokake lan disebarake ing saindenging membran ER, kaya sing diamati dening mikroskop konvensional (Gambar 4, A lan B). Kajaba iku, persentase gedhe ERES (67%) kalebu rong jinis kargo sing ana ing kono (Gambar 4D). Panel 1 lan 2 saka Gambar 4C nuduhake rong conto khas ERES kanthi Gas1-GFP lan Mid2-GFP sing tumpang tindih. Kajaba iku, loro barang kasebut direkrut menyang ERES sing padha (Gambar 4E, panel 3 lan film S4). Mulane, asil kita nuduhake yen dawa rantai seramida asil ing membran ER minangka penentu penting agregasi lan klasifikasi protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 sing ngekspresikake sekresi sing diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ijo) lan Mid2-iRFP (TMP, biru) lan konstitutif ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubasi ing suhu 37°C. Terusake nganti 30 menit, mudhunake suhu dadi 24°C kanggo ngeculake sekresi, lan gambar nganggo SCLIM sawise 20 menit. (A nganti C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; bar skala, 1μm) utawa gambar belahan sel 3D (B lan C; unit skala, 0,45μm) saka 10 bagean-z sing ditandhani karo kargo lan ERES. Panel ngisor ing (B) lan panel ing (C) nampilake gambar sing diproses kanggo mung nampilake barang sing ana ing ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) lan Mid2-iRFP (biru enom)]. (C) Panah sing diisi putih: ERES, barang tumpang tindih. Panah mbukak: ERES mung ngemot siji item. Panel ngisor: ERES sing dipilih duwe barang sing tumpang tindih (1 lan 2) sing ditandhani ing (C). Bilah skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf sing diterangake ing (C). Ing unit sec31-1 lan sec31-1 GhLag1, mung siji kargo (Gas1-GFP utawa Mid2-iRFP) sing kalebu, lan persentase rata-rata ERES kanggo kargo sing terisolasi lan kargo sing tumpang tindih. Ing telung eksperimen independen, n = 432 ing 54 sel (sec31-1) lan n = 430 ing 47 sel (sec31-1 GhLag1). Bilah kesalahan = SD. Uji t rong sisi sing ora dipasangake. *** P = 0,0002 (sec31-1) lan ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES sing dipilih kanthi kargo sing tumpang tindih (3) ditandhani ing (C). Gas1-GFP (ijo) lan Mid2-iRFP (biru) nyedhaki ERES (magenta) saka sisih sing padha lan tetep ana ing area ERES sing diwatesi. Skala bar, 100 nm.
Panliten iki menehi bukti langsung in vivo manawa kargo protein adhedhasar lipid diklasifikasikake dadi situs ekspor selektif ing jalur sekretori, lan mbukak pentinge dawa rantai asil kanggo selektivitas klasifikasi. Nggunakake teknik mikroskopi sing kuat lan canggih sing diarani SCLIM, kita nduduhake Gas1-GFP sing mentas disintesis (membran plasma utama GPI-AP kanthi bagean lipid seramida rantai asil (C26) sing dawa banget) ing ragi) Wilayah sing dikelompokake ing ER diskrit digandhengake karo ERES tartamtu, dene protein sing disekresi transmembran disebar ing saindenging membran ER (Gambar 1). Kajaba iku, rong jinis barang iki mlebu ERES sing beda kanthi selektif (Gambar 2). Dawane rantai asil saka seramida seluler ing membran dikurangi saka C26 dadi C18-C16, kluster Gas1-GFP diganggu menyang wilayah ER diskrit, lan Gas1-GFP dialihake kanggo ninggalake ER karo protein transmembran liwat ERES sing padha (Gambar 3 lan Gambar 3). 4).
Senajan GPI-AP nggunakake mekanisme protein khusus kanggo metu saka ER, kita nemokake yen pamisahan sing gumantung karo seramida C26 ora gumantung marang interaksi protein diferensial sing bisa nyebabake spesialisasi ERES (Gambar S4 lan S5). Nanging, temuan kita ndhukung mekanisme klasifikasi alternatif sing didorong dening kluster protein berbasis lipid lan pengecualian kargo liyane. Pengamatan kita nuduhake yen wilayah utawa kluster Gas1-GFP sing ana gandhengane karo ERES tartamtu ora duwe protein sing disekresi transmembran Mid2-iRFP, sing nuduhake yen kluster GPI-AP sing gumantung karo seramida C26 bakal nggampangake mlebune menyang ERES sing relevan, lan ing wektu sing padha, ngilangi sekresi transmembran mlebu ERES tartamtu iki (Gambar 1 lan 2). Kosok baline, anane seramida C18-C16 ing membran ER ora nyebabake GPI-AP mbentuk wilayah utawa kluster, mula ora ngilangi utawa ngganti protein sing disekresi transmembran menyang ERES sing padha (Gambar 3 lan 4). Mulane, kita ngusulake supaya seramida C26 ndorong pamisahan lan klasifikasi kanthi nggampangake kluster protein sing ana gandhengane karo ERES tartamtu.
Kepiye carane nggayuh kluster sing gumantung karo seramida C26 iki menyang area ER tartamtu? Kecenderungan seramida membran kanggo misahake kanthi lateral bisa nyebabake GPI-AP lan seramida C26 mbentuk lipid cilik lan langsung teratur ing lingkungan lipid sing luwih ora teratur saka membran ER sing ngemot gliserolipid sing luwih cendhek lan ora jenuh. Kluster kualitas (17, 18). Kluster sementara cilik iki bisa digabungake maneh dadi kluster sing luwih gedhe lan luwih stabil sawise naleni menyang kompleks p24 (34). Konsisten karo iki, kita nuduhake yen C26 Gas1-GFP kudu sesambungan karo kompleks p24 kanggo mbentuk kluster sing luwih gedhe sing katon (Gambar 3). Kompleks p24 minangka oligomer heterozigot sing kasusun saka papat protein transmembran p24 sing beda ing ragi (35), sing nyedhiyakake ikatan multivalen, sing bisa nyebabake cross-linking kluster GPI-AP cilik, saengga ngasilake kluster Stabil sing luwih gedhe (34). Interaksi antarane ektodomain protein GPI-AP uga bisa nyumbang kanggo agregasi, kaya sing dituduhake sajrone transportasi Golgi ing sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Nanging, nalika seramida C18-C16 ana ing membran ER, nalika kompleks p24 kaiket karo Gas1-GFP, kluster gedhe sing kapisah ora bakal kawangun. Mekanisme sing ndasari bisa uga gumantung marang sifat fisik lan kimia spesifik saka seramida rantai asil dawa. Panliten biofisika membran buatan nuduhake yen sanajan seramida rantai asil dawa (C24) lan cendhak (C18-C16) bisa nyebabake pamisahan fase, mung seramida rantai asil dawa (C24) sing bisa ningkatake Kelengkungan dhuwur lan lenturan film kanggo mbentuk maneh film kasebut. Liwat referensi bebarengan (17, 37, 38). Wis dituduhake yen heliks transmembran TMED2, homolog manungsa saka Emp24, kanthi selektif berinteraksi karo sphingomyelin adhedhasar seramida C18 ing lobulus sitoplasma (39). Nggunakake simulasi dinamika molekuler (MD), kita nemokake yen ceramide C18 lan C26 nglumpuk ing sekitar lobulus sitoplasma heliks transmembran Emp24, lan duwe preferensi sing padha (Gambar S6). Perlu dicathet yen iki nuduhake yen heliks transmembran Emp24 bisa nyebabake distribusi lipid asimetris ing membran. Iki minangka asil anyar adhedhasar sel mamalia. Simulasi MD sing padha uga nuduhake anané lipid eter (40). Mulane, kita berspekulasi yen ceramide C26 ing rong lobulus ER26 diperkaya sacara lokal. Nalika GPI-AP ing lobulus luminal langsung kaiket karo p24 multivalen lan akumulasi ceramide C26 ing sekitar p24 ing lobulus sitoplasma, bisa ningkatake agregasi protein lan kelengkungan membran sing diasilake liwat driji (41), nyebabake GPI-AP misah dadi wilayah diskrit sing cedhak karo ERES, sing uga luwih seneng wilayah membran ER sing mlengkung banget (42). Laporan sadurunge ndhukung mekanisme sing diusulake (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen utawa antibodi menyang glikosfingolipid berbasis seramida (GSL) ing membran plasma micu agregasi GSL sing gedhe, nambah pamisahan fase lan nyebabake deformasi lan internalisasi membran (44). Iwabuchi lsp. (43) Ditemokake manawa ing ngarsane rantai asil sing dawa (C24) nanging ora cendhak (C16), ligan multivalen sing kaiket karo laktosilceramide GSL nyebabake pembentukan kluster gedhe lan invaginasi membran, lan transduksi sinyal sing dimediasi Lyn sitoplasma ing leaflet diinterdigitalisasi dening rantai asil ing neutrofil sing digabungake.
Ing sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) nganti tingkat membran plasma apikal ngontrol pamisahan lan pamilahan GPI-AP (10, 45). Agregasi iki didorong dening oligomerisasi GPI-AP (36), nanging uga bisa gumantung saka dawa rantai seramida sing ditemokake ing ragi. Sanajan GPI-AP mamalia duwe jangkar adhedhasar lipid eter, lan struktur kimiane beda banget karo seramida rantai asil sing dawa banget, panliten anyar nemokake manawa loro lipid kasebut duwe sifat fisik lan kimia sing padha sacara evolusioner lan fungsi (40). Mulane, bagean lipid eter ing sel mamalia bisa uga padha karo seramida C26 ing ragi, lan perane yaiku digandhengake karo seramida rantai dawa ing membran kanggo ningkatake agregasi lan pamilahan GPI-AP. Sanajan kemungkinan iki isih kudu diuji langsung, temuan sadurunge ndhukung manawa transportasi seramida rantai asil dawa menyang awak Golgi ora ditindakake dening protein transfer sitoplasma, nanging gumantung saka sintesis jangkar GPI kaya ragi. Mulane, mekanisme konservatif evolusioner katon bisa kanthi selektif ngangkut seramida rantai asil sing dawa banget lan GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ing vesikel transportasi sing padha.
Ing sistem sel epitel terpolarisasi ragi lan mamalia, agregasi lan pamisahan GPI-AP saka protein membran plasma liyane kabeh kedadeyan sadurunge tekan permukaan sel. Paladino et al. (48) nemokake manawa ing TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, kluster GPI-AP ora mung perlu kanggo klasifikasi selektif GPI-AP menyang membran plasma apikal, nanging uga ngatur organisasi kluster GPI-AP lan aktivitas biologis. Permukaan sel. Ing ragi, panliten iki nuduhake manawa kluster GPI-AP sing gumantung karo seramida C26 ing ER bisa ngatur organisasi kluster lan aktivitas fungsional GPI-AP ing membran plasma (24, 49). Konsisten karo model iki, sel GhLag1 alergi marang inhibitor GPI utawa obat sing mengaruhi integritas dinding sel (28), lan kabutuhan kluster Gas1-GFP fungsional (49) saka seramida pucuk sing diproyeksikan ing kawin sel ragi nuduhake G​​​ Akibat fisiologis sing bisa kedadeyan saka sel hLag1. Kesalahan GPI-AP. Nanging, uji coba luwih lanjut apa organisasi fungsional permukaan sel wis diprogram saka ER kanthi metode pengurutan adhedhasar dawa lipid bakal dadi subyek riset ing mangsa ngarep.
Galur Saccharomyces cerevisiae sing digunakake ing karya iki kadhaptar ing Tabel S1. Galur MMY1583 lan MMY1635 saka SCLIM kanggo pencitraan sel urip dibangun ing latar mburi W303. Galur iki sing ngekspresikan Sec13-mCherry kanthi tag protein fluoresen dibangun nggunakake metode adhedhasar reaksi rantai polimerase (PCR) kanthi plasmid pFA6a minangka cithakan (23). Galur sing ngekspresikan Mid2-iRFP sing dilabeli protein fluoresen ing sangisore kontrol promotor GAL1 dibangun kaya ing ngisor iki. Amplifikasi PCR saka urutan iRFP-KanMx saka vektor pKTiRFP-KAN (hadiah saka E. O'Shea, nomer plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengenal sumber daya riset (RRID): Addgene_64687) Lan dilebokake ing C-terminus Mid2 endogen. Sawisé urutan genom Mid2-iRFP diamplifikasi lan diklon menyang promotor GAL1, urutan kasebut diintegrasi menyang situs Not I-Sac I saka plasmid integrasi pRS306. Plasmid sing diasilake pRGS7 dilinierisasi karo Pst I kanggo diintegrasi menyang lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP diekspresikan ing sangisore kontrol promotor GAL1 ing plasmid sentromer (CEN), sing dibangun kaya ing ngisor iki. Urutan Gas1-GFP diamplifikasi dening PCR saka plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah saka L. Popolo) lan diklon menyang situs Xma I–Xho I saka plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah saka C). Miller; Nomer plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid sing diasilake dijenengi pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP uga diekspresikan ing sangisore kontrol promotor GAL1 saka vektor pBEVY-GL LEU2, lan konstruksine kaya ing ngisor iki. Urutan Axl2-GFP diamplifikasi saka plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) nganggo PCR, lan diklon menyang situs Bam HI-Pst I saka vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid sing diasilake dijenengi pRGS12. Urutan oligonukleotida sing digunakake ing panliten iki kadhaptar ing Tabel S2.
Galur iki ditambah karo 0,2% adenin lan 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-raffinose] ekstrak ragi sugih protein p (YP) medium (1% Ekstrak ragi lan 2% protein ept). (YPR)] utawa 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] minangka sumber karbon, utawa ing medium minimal sintetik (0,15% basa nitrogen ragi lan 0,5% amonium sulfat) kanggo nambahi asam amino lan basa sing cocog sing dibutuhake kanggo nutrisi, lan ngandhut 2% glukosa (media minimal glukosa sintetik) utawa 2% galaktosa (media minimal galaktosa sintetik) minangka sumber karbon.
Kanggo pencitraan wektu nyata, sel mutan sec31-1 sing sensitif suhu sing ngekspresikake konstruksi ing sangisore promotor GAL1 ditumbuhake ing medium YPR ing suhu 24°C sewengi nganti fase tengah log. Sawise induksi ing YPG ing suhu 24°C sajrone 1 jam, sel kasebut diinkubasi ing SG ing suhu 37°C sajrone 30 menit, banjur ditransfer menyang 24°C kanggo ngeculake saka blok sekresi. Concanavalin A digunakake kanggo ndandani sel ing slide kaca lan dicitrakake dening SCLIM. SCLIM minangka kombinasi saka mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 lan lensa lenga aperture numerik UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), pemindai confocal cakram puteran kanthi kecepatan dhuwur lan rasio sinyal-kanggo-noise dhuwur (Yokogawa Electric), spektrometer khusus, lan pendinginan khusus. Intensifier gambar sistem (Hamamatsu Photonics) bisa nyedhiyakake sistem lensa pembesar kanthi pembesaran pungkasan × 266,7 lan kamera piranti sing digandeng muatan sing ngalikake elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Akuisisi gambar ditindakake dening piranti lunak khusus (Yokogawa Electric). Kanggo gambar 3D, kita nggunakake aktuator piezoelektrik khusus kanggo nggeterake lensa objektif kanthi vertikal, lan ngumpulake bagean optik kanthi jarak 100 nm ing tumpukan. Gambar tumpukan-Z diowahi dadi data voxel 3D, lan fungsi panyebaran titik teoretis sing digunakake kanggo mikroskop confocal cakram puteran digunakake kanggo proses dekonvolusi dening piranti lunak Volocity (PerkinElmer). Kanthi nggunakake piranti lunak Volocity kanggo kanthi otomatis nyetel ambang batas kanggo analisis lokasi bebarengan, ERES kalebu kargo diukur. Analisis pindai garis ditindakake nggunakake piranti lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Gunakna piranti lunak GraphPad Prism kanggo nemtokake signifikansi statistik. Kanggo uji-t Student rong sisi lan uji analisis varians siji arah biasa (ANOVA), bedane antarane klompok dianggep duwe pengaruh sing signifikan marang P <0,05 (*).
Kanggo mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log ditumbuhake sewengi ing YPD lan dikumpulake kanthi sentrifugasi, dikumbah kaping pindho nganggo larutan garam buffer fosfat, lan diinkubasi ing es paling ora 15 menit, banjur diterusake ing mikroskop kaya sing wis diterangake sadurunge. Priksa (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 lenga PH3 CS) sing dilengkapi lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu lan piranti lunak Application Suite X (LAS X) digunakake kanggo akuisisi.
Sampel-sampel kasebut didenaturasi nganggo buffer sampel SDS ing suhu 65°C sajrone 10 menit, banjur dipisahake nganggo elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Kanggo analisis imunoblotting, 10 μl sampel dimuat saben jalur. Antibodi utama: Gunakake anti-Gas1 poliklonal terwelu kanthi pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal terwelu kanthi pengenceran 1:500, lan anti-GFP poliklonal terwelu (hadiah saka H. Riezman) kanthi pengenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus digunakake kanthi pengenceran 1:5000 (hadiah saka J. de la Cruz). Antibodi sekunder: imunoglobulin G (IgG) anti-terwelu wedhus sing dikonjugasi karo peroksidase horseradish (HRP) sing digunakake kanthi pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti-tikus wedhus konjugasi HRP digunakake kanthi pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respon imun diamati kanthi metode kemiluminesensi reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Kaya sing diterangake ing (31), eksperimen imunopresipitasi alami ditindakake ing fraksi ER sing diperkaya. Cekakipun, cuci sel ragi nganggo buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida lan campuran inhibitor protease) ing 600 nm (OD600) kanthi kapadhetan optik 100 kaping pindho. Iki dipecah nganggo manik-manik kaca, banjur lebu sel lan manik-manik kaca dicopot kanthi sentrifugasi. Supernatan banjur disentrifugasi ing 17.000 g sajrone 15 menit ing suhu 4°C. Pelet kasebut disuspensi maneh ing TNE lan saponin digitalis ditambahake nganti konsentrasi pungkasan 1%. Suspensi diinkubasi sajrone 1 jam kanthi rotasi ing suhu 4°C, banjur komponen sing ora larut dicopot kanthi sentrifugasi ing 13.000 g ing suhu 4°C sajrone 60 menit. Kanggo imunopresipitasi Gas1-GFP, dhisik inkubasi sampel nganggo manik-manik agarose kosong (ChromoTek) ing suhu 4°C suwene 1 jam, banjur inkubasi nganggo GFP-Trap_A (ChromoTek) ing suhu 4°C suwene 3 jam. Manik-manik sing wis diimunopresipitasi dicuci kaping lima nganggo TNE sing ngandhut 0,2% digoxigenin, dielusi nganggo buffer sampel SDS, dipisahake ing SDS-PAGE, lan dianalisis nganggo imunoblotting.
Kaya sing diterangake ing (31), panentu cross-linking ditindakake ing fraksi ER sing diperkaya. Secara ringkes, fraksi ER sing diperkaya diinkubasi karo 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 menit). Reaksi crosslinking dipadamkan kanthi nambahake glisin (konsentrasi pungkasan 50 mM, 5 menit, 20°C).
Kaya sing wis diterangake sadurunge (50), analisis MS saka ceramide ing galur tipe liar lan GhLag1 ditindakake. Cekakipun, sel-sel kasebut ditumbuhake nganti fase eksponensial (3 nganti 4 OD600 unit/ml) ing YPD ing suhu 30°C, lan 25×107 sel dipanen. Metabolisme sel-sel kasebut dipadamkan nganggo asam trikloroasetat. Gunakake pelarut ekstraksi [etanol, banyu, eter, piridin lan 4,2 N amonium hidroksida (15:15:5:1:0,018 v/v)] lan 1,2 nmol saka standar internal C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kualitas). Gunakake reagen monometilamina [metanol, banyu, n-butanol lan larutan metilamina (4:3:1:5 v/v)] kanggo nindakake hidrolisis alkali entheng saka ekstrak kasebut, banjur gunakake n-butanol jenuh banyu kanggo nguras uyah. Pungkasanipun, ekstrak kasebut disuspensi maneh ing pelarut mode positif [kloroform/metanol/banyu (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] lan diinjeksi menyang spektrometer massa. Pemantauan multi-reaksi (MRM) ditindakake kanggo identifikasi lan kuantifikasi molekul sphingolipid. Spektrometer massa kuadrupole tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkapi sumber ion nanoflow robot Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) kanggo analisis lipid. Energi tabrakan dioptimalake kanggo saben kategori seramida. Data MS dipikolehi ing mode positif. Kanggo saben replikasi biologis, sinyal lipid minangka median saka telung pangukuran independen.
Kaya sing diterangake ing (31), sel-sel (800 × 107) sing ngekspresikake Gas1-GFP diekspresikan kanthi imunopresipitasi alami. Gas1-GFP sing wis dimurnèkaké dipisahake nganggo SDS-PAGE lan ditransfer menyang membran polivinilidena fluorida (PVDF). Protein kasebut divisualisasikake kanthi pewarnaan PVDF nganggo ireng amida. Pita Gas1-GFP dipotong saka PVDF lan dicuci kaping 5 nganggo metanol lan sapisan nganggo banyu kromatografi cair-MS (LC-MS). Kanthi nginkubasi strip membran nganggo 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer lan 500μl campuran natrium nitrit 1 M sing mentas dilarutake ing suhu 37°C sajrone 3 jam, fraksi lipid dibebasake saka Gas1-GFP lan dilisis. Pelepasan inosin fosfat seramida antarane glukosamin lan inositol (51). Sawisé kuwi, strip membran dikumbah kaping papat nganggo banyu kelas LC-MS, dikeringake ing suhu kamar, lan disimpen ing atmosfer nitrogen ing suhu -80°C nganti dianalisis. Minangka kontrol, sampel kosong membran PVDF digunakake kanggo saben eksperimen. Lipid sing diekstrak saka Gas1-GFP banjur dianalisis nganggo MS kaya sing diterangake (50). Cekakipun, strip PVDF sing ngemot GPI-lipid disuspensi maneh ing 75μl pelarut cetakan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] lan ngliwati analisis ionisasi elektrospray (ESI)-MRM/MS spesies sphingolipid (TSQ Vantage). Ing kasus iki, data MS dipikolehi ing mode ion negatif.
Kaya sing wis kasebut sadurunge, bagean lipid saka jangkar GPI dipisahake saka GPI-AP sing diwenehi label [3H]-inositol (16). Lipid dipisahake kanthi kromatografi lapisan tipis nggunakake sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) lan divisualisasikake nggunakake FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel sing ngekspresikake Gas1-GFP (600 × 107) dikumbah kaping pindho nganggo buffer TNE nganggo buffer TNE, lan dipecah nganggo manik-manik kaca, banjur disentrifugasi kanggo mbusak rereged sel lan manik-manik kaca. Supernatan banjur disentrifugasi ing 17.000 g sajrone 1 jam ing suhu 4°C. Pelet dikumbah ing TNE lan diinkubasi karo 1 U PI-PLC (Invitrogen) ing TNE sing ngemot 0,2% saponin digitalis sajrone 1 jam ing suhu 37°C. Sawise perawatan enzim, membran dicopot kanthi sentrifugasi ing 17.000 g ing suhu 4°C sajrone 1 jam. Kanggo imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan diinkubasi karo GFP-Trap_A (ChromoTek) ing suhu 4°C sewengi. Gas1-GFP sing wis dimurnèkaké dipisahake déning SDS-PAGE diwernani nganggo biru brilian Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong saka werna abu-abu sing ngubengi akuaduk, banjur sawise alkilasi nganggo iodoacetamide lan reduksi nganggo dithiothreitol, pencernaan ing-gel nganggo tripsin ditindakake. Ekstrak lan peptida triptik garing lan peptida nganggo GPI-glycans. Peptida garing dilarutake ing 20 μl banyu. Injeksi sebagian (8μl) menyang LC. Kolom oktadesilsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter njero 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefektur Aichi, Jepang) digunakake kanggo misahake peptida ing kahanan gradien tartamtu. Fase gerak yaiku pelarut A (0,08% asam format) lan pelarut B (0,15% asam format ing 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) digunakake kanggo ngelusi kolom nganggo pelarut A sajrone 55 menit kanthi laju aliran 50 μl min-1 sajrone 5 menit, banjur konsentrasi pelarut B ditambah dadi 40%. (Amerika Serikat). Eluat terus dilebokake menyang sumber ion ESI, lan peptida triptik lan peptida nganggo GPI-glikan dianalisis nganggo LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa trap-orbitrap ion linier hibrida; Thermo Fisher Scientific). Ing persiyapan MS, voltase sumber kapiler disetel dadi 4,5 kV, lan suhu kapiler transfer dijaga ing 300°C. Voltase kapiler lan voltase lensa tabung disetel dadi 15 V lan 50 V. Data MS dipikolehi ing mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagean per yuta) ing kisaran massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS dipikolehi liwat jebakan ion ing LTQ Orbitrap XL [3 digit pisanan sing dadi dhasar data, disosiasi sing disebabake tabrakan (CID)].
Simulasi MD ditindakake nggunakake piranti lunak GROMACS (52) lan medan gaya MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) banjur digunakake kanggo nggawe lapisan ganda sing ngemot dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) lan Cer C18 utawa DOPC lan Cer C26. Topologi lan koordinat Cer C26 dijupuk saka DXCE kanthi mbusak manik-manik ekstra saka buntut sphingosine. Gunakake proses sing diterangake ing ngisor iki kanggo ngimbangi lapisan ganda lan mbukak, banjur gunakake koordinat pungkasan sistem kanggo mbangun sistem sing ngemot Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 nganti 193) dibangun minangka α-helix nggunakake struktur molekul alat visual MD (VMD) (58). Banjur, sawise mbusak lipid sing tumpang tindih, protein kasebut digranulasi kasar lan dilebokake menyang lapisan ganda nggunakake CHARMM GUI. Sistem pungkasan ngandhut 1202 DOPC lan 302 Cer C26 utawa 1197 DOPC lan 295 Cer C18 lan Emp24. Ionisasi sistem nganti konsentrasi 0,150M. Papat replikasi independen digawe kanggo rong komposisi bilayer.
Lapisan lipid diimbangi nggunakake proses CHARMM GUI, sing kalebu minimalake banjur ngimbangi 405.000 langkah, ing ngendi watesan posisi dikurangi lan diilangi kanthi bertahap, lan langkah wektu ditambah saka 0,005 ps dadi 0,02 ps. Sawise keseimbangan, ngasilake 6 µs kanthi langkah wektu 0,02 ps. Sawise masang Emp24, gunakake proses CHARMM GUI sing padha kanggo minimalake lan ngimbangi sistem, banjur jalanake sajrone 8 detik ing produksi.
Kanggo kabeh sistem, sajrone proses penyeimbangan, tekanan dikontrol dening barostat Berendsen (59), lan sajrone proses produksi, tekanan dikontrol dening barostat Parrinello-Rahman (60). Ing kabeh kasus, tekanan rata-rata yaiku 1 bar lan skema kopling tekanan semi-isotropik digunakake. Ing proses keseimbangan lan produksi, termostat (61) kanthi kalibrasi ulang kecepatan digunakake kanggo nggandhengake suhu protein, lipid, lan partikel pelarut. Sajrone kabeh operasi, suhu target yaiku 310K. Interaksi non-ikatan diitung kanthi ngasilake dhaptar pasangan nggunakake skema Verlet kanthi toleransi buffer 0,005. Istilah Coulomb diitung nggunakake medan reaksi lan jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals nggunakake skema potong kanthi jarak potong 1,1 nm, lan skema potong Verlet digunakake kanggo potensial drift (62).
Nggunakake VMD, dawa gelombang cutoff antarane manik-manik fosfat DOPC utawa manik-manik seramida AM1 lan protein yaiku 0,7 nm, lan jumlah lipid sing sesambungan karo protein diitung. Miturut rumus ing ngisor iki, itung faktor pengayaan deplesi (DE) kaya ing (63): Faktor DE = (jumlah total lipid ing protein 0,7) ing protein 0,7 (jumlah Cer ing total lipid)
Nilai sing dilapurake dipikolehi minangka rata-rata, lan garis kesalahan minangka papat salinan independen saka SE. Signifikansi statistik saka faktor DE diitung nganggo uji t [(rata-rata faktor DE-1)/SE]. Hitung nilai P saka distribusi siji-sisih.
Piranti GROMACS digunakake kanggo ngetung peta kapadhetan lateral 2D saka sistem sing ngemot Emp24 sajrone 250 ns pungkasan saka jejak kasebut. Kanggo entuk peta pengayaan/penipisan ceramide, peta kapadhetan Cer dibagi karo jumlah peta Cer lan DOPC, banjur dibagi karo konsentrasi Cer ing awak. Skala peta warna sing padha digunakake.
Kanggo materi tambahan kanggo artikel iki, mangga deleng http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Iki minangka artikel akses terbuka sing disebarake miturut syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sing ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi ing media apa wae, anggere panggunaan pungkasan ora kanggo keuntungan komersial lan premise yaiku karya asline bener. Referensi.
Cathetan: Kita mung njaluk sampeyan menehi alamat email supaya wong sing sampeyan rekomendasikake menyang kaca kasebut ngerti yen sampeyan pengin dheweke ndeleng email kasebut lan dudu spam. Kita ora bakal nangkep alamat email apa wae.
Pitakonan iki digunakake kanggo nguji apa sampeyan pengunjung lan nyegah kiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wektu nyata resolusi dhuwur 3D nuduhake pentinge dawa rantai ceramide kanggo pamilahan protein ing situs output selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan wektu nyata resolusi dhuwur 3D nuduhake pentinge dawa rantai ceramide kanggo pamilahan protein ing situs output selektif.
© 2020 American Association for the Advancement of Science. kabeh hak dilindhungi undhang-undhang. AAAS minangka mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef lan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.