Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Ora kaya vertebrata, serangga dianggep ora duwe hormon steroid seks sing bias lanang. Ing Anopheles gambiae, steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) katon wis berkembang kanggo ngontrol perkembangan endhog nalika disintesis dening wadon2 lan kanggo ngindhuksi periode refraktori kawin nalika ditransfer sacara seksual dening lanang3. Amarga perkembangan endhog lan kawin minangka sipat reproduksi sing penting, mangerteni kepiye nyamuk Anopheles wadon nggabungake sinyal hormonal iki bisa nggampangake desain program kontrol malaria anyar. Ing kene, kita mbukak manawa fungsi reproduksi iki diatur dening steroid seks sing beda liwat jaringan kompleks enzim sing ngaktifake/inaktivasi ecdysteroid. Kita ngidentifikasi ecdysone teroksidasi khusus lanang, 3-dehydro-20E (3D20E), sing nglindhungi parentage kanthi nutup reseptivitas seksual wadon sawise transfer seksual lan aktivasi kanthi dephosphorylation. Khususé, transfer 3D20E uga nyebabake ekspresi gen reproduksi sing njaga perkembangan endhog sajrone infeksi Plasmodium, njamin kesehatan wadon sing kena infeksi. 20E sing asale saka wadon ora nyebabake seksual respon, nanging ngidini individu sing kawin ngendhog sawise kinase penghambat 20E dihambat. Identifikasi hormon steroid serangga spesifik lanang iki lan perane ing ngatur reseptivitas seksual wanita, kesuburan lan interaksi karo Plasmodium nuduhake potensi kanggo nyuda sukses reproduksi nyamuk sing nularake malaria.
Kasus malaria lan kematian saya tambah akeh4 amarga resistensi insektisida sing nyebar ing nyamuk Anopheles, siji-sijine vektor parasit malaria manungsa. Biologi kawin nyamuk iki minangka target sing menarik banget kanggo intervensi kontrol malaria anyar amarga nyamuk wadon mung kawin sapisan5; nggawe acara kawin tunggal iki steril bakal duwe potensi gedhe kanggo nyuda populasi nyamuk ing lapangan.
Wanita dadi ora bisa nindakake hubungan seksual sawise nampa hormon steroid kanthi titer dhuwur saka pria. Panliten nuduhake yen pemicu kangelan ing kawin luwih lanjut yaiku 20-hydroxyecdysone (20E), hormon steroid sing luwih dikenal minangka regulator siklus ganti kulit ing tahap larva. Kemampuan lanang kanggo nyintesis lan nransfer 20E wis berkembang khusus ing spesies Anopheles sing minangka bagean saka subgenus Cellia7, sing kasebar ing Afrika lan kalebu vektor malaria sing paling mbebayani, kalebu Anopheles gambiae. Iki penting banget amarga ing spesies iki, wadon uga ngasilake 20E sawise saben mangan getih, lan 20E ndorong siklus oogenesis (waca ref. 8). Nanging, sethithik sing dingerteni babagan cara wadon nggabungake sinyal saka rong sumber ecdysone sing beda (transfer lanang lan induksi mangan getih) tanpa ngorbanake kemampuan dhewe kanggo kawin. Nyatane, yen 20E sing diasilake dening wadon micu intoleransi seksual, iki bakal nyebabake infertilitas ing individu sing mangan prawan, prilaku sing umum banget ing nyamuk iki5.
Panjelasan sing bisa ditindakake yaiku A. gambiae lanang nransfer ecdysone khusus lanang sing dimodifikasi, sing ngaktifake kaskade sinyal ing saluran reproduksi wadon, sing nyebabake ketidakstabilan kawin. Nanging, sanajan vertebrata duwe pirang-pirang hormon steroid, kayata estrogen lan androgen (ditinjau ing ref. 9), miturut kawruh kita, steroid sing bias androgenik durung diidentifikasi ing serangga.
Kita miwiti kanggo nemtokake repertoar hormon steroid ing kelenjar aksesoris lanang lanang (MAG) saka A. gambiae sing wis diwasa sacara seksual kanggo nggoleki steroid sing bisa ngowahi. Nggunakake kromatografi cair kinerja dhuwur sing digabungake karo spektrometri massa tandem (HPLC-MS/MS) tinimbang metode sing kurang spesifik sing digunakake sadurunge, kita ndeteksi ecdysone (E) lan 20E ing jaringan iki, sing ngonfirmasi asil sadurunge. Nanging, sampel kasebut didominasi dening steroid terfosforilasi teroksidasi, konsisten karo formula 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Gambar 1). Bentuk liyane kalebu 3-dehidro-20E (3D20E) lan 20E-22-fosfat (20E22P). Intensitas sinyal HPLC-MS/MS saka 3D20E22P rong urutan gedhene luwih dhuwur tinimbang bentuk defosforilasi, 3D20E, lan telung urutan gedhene luwih dhuwur tinimbang E lan 20E (Gambar 1). Sanajan ing bagean awak liyane lan saluran reproduksi ngisor (LRT; Gambar Data Tambahan 1a). Kita uga nganalisa ekdisteroid ing lanang lan wadon sing nembe ditutup (<1 dina) lan ndeteksi 3D20E lan 3D20E22P mung ing MAG; E, 20E lan 20E22P ana ing loro jinis kelamin (Gambar Data Tambahan 1b). Data kasebut nuduhake yen lanang diwasa A. gambiae ngasilake titer hormon modifikasi sing dhuwur ing MAG sing ora disintesis dening wadon.
MAG lan LRT wadon (kalebu atrium, vesikula seminalis, lan parovarium) dibedah saka lanang prawan umur 4 dina (umur 4 dina) lan wadon prawan lan sing wis kawin (0,5, 3, lan 12 hpm). Ecdysone ing jaringan kasebut dianalisis nganggo HPLC-MS/MS (rata-rata ± sem; uji-t sing ora dipasangake, rong sisi, tingkat panemuan palsu (FDR) dikoreksi; NS, ora signifikan; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,035; 12 jam vs. 3 jam, P = 0,0015; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,030. 3D20E22P: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,25; 12 jam vs. 3 jam, P = 0,0032; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,015). Data saka telung replikasi biologis. Area puncak kanggo saben ecdysone sing diminati diitung lan dinormalisasi miturut jumlah nyamuk. Ecdysone diwakili dening warna kaya ing ngisor iki: E, ijo; 20E, oranye; 20E22P, ungu; 3D20E, biru; 3D20E22P, jambon. Sisipan nambah skala ing sumbu y kanggo nuduhake tingkat ecdysone sing luwih murah.
Kanggo nyelidiki apa 3D20E22P lan 3D20E ditransfer nalika kawin, kita mbedah LRT wadon ing macem-macem titik wektu sawise kawin. Sanajan ecdysone ora ditemokake ing prawan, kita mirsani jumlah 3D20E22P sing substansial ing LRT langsung sawise kawin (0,5 jam sawise kawin, hpm), mudhun suwe-suwe, dene tingkat 3D20E tambah akeh (Gambar 1). Nggunakake 3D20E sing disintesis sacara kimia minangka standar, kita nemtokake manawa tingkat hormon steroid iki ing LRT kawin paling ora 100 kali lipat luwih dhuwur tinimbang 20E (Tabel Data Tambahan 1). Dadi, 3D20E22P minangka ecdyson lanang utama sing ditransfer menyang LRT wadon sajrone kawin, lan bentuk defosforilasi, 3D20E, dadi akeh banget sawise kawin. Iki nuduhake peran penting kanggo ecdysone sing terakhir ing biologi sawise kawin wadon.
Sawise ngasilake dataset sekuensing RNA (RNA-seq) anyar (Gambar 2a), nggunakake pipa bioinformatika sing digawe khusus, kita nggoleki ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), lan gen fosfatase sing dimodifikasi 20E sing diekspresikan ing jaringan reproduksi. Kita ngidentifikasi siji gen EPP kandidat lan rong gen EcK potensial (EcK1 lan EcK2), nanging ora bisa nemokake gen EO kandidat sing apik. Khususé, gen EPP individu diekspresikan ing tingkat dhuwur (persentil kaping 98,9) ing MAG Gambia nanging ora ing LRT wanita (Gambar 2b), beda karo pangarepan kita amarga defosforilasi 3D20E22P kedadeyan ing jaringan wanita iki. Mulane, kita percaya yen EPP pria bisa ditransfer nalika kawin. Pancen, kita nggunakake label isotop stabil in vivo kanggo nutupi protein wanita sawise kawin, enzim sing diidentifikasi dening MS ing atrium wanita (Gambar 2c lan Tabel Tambahan 1). Anane EPP ing MAG lan LRT wadon sing wis dikawinke (nanging ora prawan) uga dikonfirmasi nggunakake antibodi spesifik (Gambar 2d).
a, Pipa bioinformatika sing digawe khusus kanggo nggoleki jaringan reproduksi saben jinis kanggo gen sing ngode EcKs, EOs, lan EPPs. Angka ing jejere panah nuduhake jumlah calon lanang lan wadon ing saben langkah. Analisis iki ngidentifikasi siji gen EPP (EPP) lan siji gen EcK (EcK1) sing diekspresikan ing lanang, lan siji gen EcK (EcK2) sing diekspresikan ing loro jinis nanging ora ngasilake calon gen EO. b, Peta panas sing mbandhingake ekspresi gen calon ing jaringan Anopheles gambiae lan Anopheles albicans sing prawan (V) lan kawin (M). Spca, pembuahan; MAGs, kelenjar aksesoris ing lanang; bagean awak liyane, kalebu dhadha, swiwi, sikil, awak lemu, lan organ internal ing loro jinis kelamin, lan ovarium ing wanita. EcK2 diekspresikan kanthi dhuwur ing MAG lan atrium Gambia, dene EPP mung ditemokake ing MAG.c, Analisis proteomik translokasi klompok ejakulasi lanang menyang atrium wanita ing 3, 12 lan 24 hpm, nuduhake 67 protein sing paling akeh. Wadon digedhekake kanthi diet sing ngemot 15N kanggo menehi label (lan nutupi) kabeh protein. Lanang sing ora ditandai dikawinake karo wadon sing ditandai, lan LRT wadon dibedah ing 3, 12 lan 24 hpm kanggo analisis proteomik (waca Tabel Tambahan 1 kanggo dhaptar lengkap protein ejakulasi). Inset, EPP, Eck1 lan EcK2 dideteksi ing MAG lanang prawan kanthi analisis proteomik jaringan kasebut.d, EPP dideteksi dening western blot ing MAG lan LRT wadon sing dikawinake, nanging ora ing wadon prawan utawa lanang utawa awak wadon liyane. Membran bebarengan diuji nganggo antibodi anti-aktin (kontrol pemuatan) lan anti-EPP. Kabeh lanang isih prawan. Deleng Gambar Tambahan 1 kanggo data sumber gel. Western blots ditindakake kaping pindho kanthi asil sing padha.
Aktivitas fosfofosfatase ekdisteroid saka EPP diverifikasi sawise inkubasi dening HPLC-MS/MS karo 3D20E22P sing diisolasi saka MAG (Data Tambahan Gambar 2a). Salajengipun, nalika kita ngendhegake EPP kanthi gangguan sing dimediasi RNA (RNAi), kita ndeteksi pengurangan aktivitas fosfatase sing kuwat ing jaringan reproduksi lanang iki (Gambar 3a), lan wadon sing dikawinake karo lanang sing dibungkam EPP nuduhake proporsi 3D20E sing didefosforilasi sing luwih murah (Gambar 3b) sanajan ana pembungkam gen parsial (Data Tambahan Gambar 2b, c). Kosok baline, kita ora ndeteksi owah-owahan sing signifikan ing rasio 20E22P/20E ing nyamuk sing padha, sing bisa uga nuduhake yen enzim kasebut spesifik kanggo 3D20E22P (Gambar 3b).
a, Aktivitas fosfatase sing mudhun ing MAG disebabake dening pembungkaman EPP nggunakake kontrol EPP RNA untai ganda (dsEPP) utawa GFP RNA untai ganda (dsGFP). Rong puluh kolam MAG digunakake ing saben replikasi (P = 0,0046, uji-t pasangan, rong sisi), diwakili dening titik-titik sing kapisah. b, Badhak wadon sing dikawinake karo lanang sing dibungkaman EPP duwe proporsi 3D20E sing didefosforilasi sing luwih murah ing 3 hpm (P = 0,0043, uji-t sing ora dipasangake, rong sisi), dene tingkat 20E ora kena pengaruh (P = 0,063, ora dipasangake). t-test, rong sisi). Data ditampilake minangka rata-rata ± sem saka telung klompok sing saben klompok dumadi saka 13, 16, lan 19 wadon. c, Badhak wadon sing dikawinake karo lanang sing dibungkem EPP duwe tingkat kawin maneh sing luwih dhuwur (P = 0,0002, tes pas Fisher, rong sisi). Badhak wadon pisanan dipeksa kawin kanggo njamin status kawine; 2 dina sabanjure, dheweke dikontak karo lanang liyane sing nggawa sperma transgenik kanggo netepake tingkat kawin maneh kanthi deteksi PCR kuantitatif transgen kasebut. d, wadon sing diwenehi getih sing dikawinake karo lanang sing dibungkem EPP duwe kesuburan sing mudhun sacara signifikan (P < 0,0001; tes Mann-Whitney, rong sisi) lan jumlah endhog sing rada mudhun (P = 0,088, tes Mann-Whitney, rong sisi), dene tingkat pemijahan ora kena pengaruh (P = 0,94, tes pas Fisher, rong sisi). Ing kabeh panel, n makili jumlah sampel nyamuk sing ora gumantung sacara biologis. NS, ora signifikan. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Sabanjure, kita ngevaluasi apa defosforilasi ekdison penting kanggo nyebabake resistensi kawin ing wanita. Utamane, wanita sing kawin karo pria sing kurang EPP kawin maneh kanthi frekuensi sing luwih dhuwur (44,9%) tinimbang wanita kontrol (10,4%) nalika kena pengaruh pria (transgenik) tambahan (Gambar 3c). Kita uga mirsani penurunan kesuburan sing signifikan (Gambar 3d, kiwa) lan penurunan sithik ing jumlah endhog sing dilelehake dening wanita kasebut (Gambar 3d, tengah), dene persentase endhog sing dilelehake dening wanita (respon liyane sing ditimbulake ing wanita kanthi kawin)) ora kena pengaruh (Gambar 3d, tengen). Amarga spesifisitas EPP sing diamati kanggo 3D20E22P, asil kasebut nuduhake yen aktivasi 3D20E dening EPP sing ditransfer sajrone kawin bisa uga duwe peran penting kanggo mateni reseptivitas wanita kanggo kawin luwih lanjut, prilaku sing sadurunge dianggep minangka transfer seksual 20E. Mulane, hormon khusus pria iki uga banget mengaruhi kesuburan wanita.
Sabanjure, kita mbandhingake aktivitas 20E lan 3D20E ing eksperimen injeksi ing prawan sing wis diwasa sacara seksual nggunakake 3D20E sing disintesis sacara kimia (Gambar 4a-c) lan 20E sing kasedhiya sacara komersial. Kita mirsani manawa 3D20E luwih efektif tinimbang 20E kanggo mateni sensitivitas wanita kanggo kawin ing loro konsentrasi kasebut (Gambar 4d). Khususé, setengah tingkat fisiologis 3D20E ing LRT (1.066 pg pasca injeksi vs. 2.022 pg pasca kawin) nyebabake proporsi wanita refraktori sing 20 kali luwih dhuwur tinimbang tingkat fisiologis 20E (361 pg pasca injeksi) 24 jam sawise injeksi ing konsentrasi paling dhuwur 18 pg pasca kawin; Tabel Data Tambahan 1). Asil iki konsisten karo gagasan yen transfer seksual 20E ora nyebabake periode refraktori kawin, lan luwih lanjut nuduhake 3D20E minangka faktor utama kanggo njamin hubungan wong tuwa-anak. 3D20E uga luwih aktif tinimbang 20E ing uji ngendhog ing wanita prawan (Gambar 4e), sing nuduhake yen tingkat ngendhog normal sing diamati sawise pembungkaman EPP parsial amarga anane aktivitas 3D20E residual sing isih diasilake dening faktor wanita sing diinduksi kawin.
(a,b) 3D20E disintesis sacara kimia saka 20E (a) kanthi konversi/efisiensi sing dhuwur banget (data sing ditampilake minangka rata-rata ± sem saka telung reaksi sintesis independen) (b).c, Spektrum massa (setengah ngisor) persis cocog karo ekdyson sing ditemokake ing LRT wadon sing dikawinke (setengah ndhuwur).d, Dibandhingake karo 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Tes eksak Fisher, rong sisi) lan 10% etanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Tes eksak Fisher, 2 sisi), dene 20E luwih dhuwur tinimbang kontrol mung ing dosis sing luwih dhuwur (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Tes eksak Fisher, 2 sisi).e, Injeksi 3D20E nyebabake tingkat pemijahan sing luwih dhuwur ing wanita prawan tinimbang kontrol etanol 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Tes eksak Fisher, rong sisi), dene 20E dibandhingake karo kontrol Mung ing dosis sing luwih dhuwur (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Tes eksak Fisher, rong sisi). 3D20E nyebabake tingkat pemijahan sing luwih dhuwur tinimbang 20E ing dosis sing luwih dhuwur (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Tes eksak Fisher, rong sisi). Ing kabeh panel, n makili jumlah sampel nyamuk sing ora gumantung sacara biologis. NS, ora signifikan. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0.001. Data saka telung replikasi.
Ing panliten sadurunge, kita nemtokake manawa transfer seksual hormon steroid nyebabake ekspresi MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gen reproduksi wanita sing nglindhungi wanita A. gambiae saka infeksi P. falciparum. Biaya kesehatan sing disebabake dening 13, parasit malaria manungsa sing paling mematikan. Amarga pentinge MISO kanggo kebugaran reproduksi Anopheles ing wilayah endemik malaria, kita mutusake kanggo nemtokake hormon 3D20E utawa 20E sing micu ekspresi gen iki. Kita nemokake manawa nalika injeksi 20E khusus utawa luwih kuat nyebabake sawetara reseptor hormon nuklir (HR), kayata HR3 lan HR4, lan target steroid hilir khas, kayata gen yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO luwih kuat diinduksi dening 3D20E (Extended Data Fig. 3). Dadi, transfer seksual hormon steroid androgenik iki katon nyebabake mekanisme sing nglindhungi wanita saka biaya sing disebabake dening infeksi parasit. Salajengipun, 3D20E kanthi beda mengaruhi loro isoform saka Reseptor E EcR, sing nyebabake EcR-A lan nyegah EcR-B, lan luwih kuat micu gen-gen liyane sing nyebabake kawin, kalebu HPX15, sing mengaruhi kesuburan wanita. Iki bisa nerangake infertilitas sing signifikan sing diamati ing wanita sing dikawinake karo pria sing dibungkem EPP (Gambar Data Tambahan 3). Data kasebut nuduhake anane jalur hilir sing luwih disenengi dening rong hormon ekdysone sing bisa ndasari fungsi khusus jenis kelamin.
Sabanjure, kita nguji fungsi saka rong gen EcK sing diidentifikasi ing pipa bioinformatika kita. Nghentikake EcK1 utawa EcK2 nyebabake kematian sing signifikan ing lanang (Gambar Data Tambahan 4a), sing nuduhake yen fosforilasi ecdysone, lan kanthi mangkono inaktivasi, penting kanggo kaslametan. Amarga EcK2 diekspresikan ing tingkat sing luwih dhuwur tinimbang EcK1 lan dideteksi ing MAG dening proteomik (Gambar 2b, c lan Tabel Tambahan 2), kita validasi aktivitas ecdysteroid kinase kanthi inkubasi karo 20E, sing nyebabake fosforilasi 20E22P (Gambar Data Tambahan 2).4b). Nalika nggunakake 3D20E minangka substrat, kita ora bisa ndeteksi produk terfosforilasi 3D20E22P (Gambar Data Tambahan 4c), sing nuduhake yen 20E tinimbang 3D20E bisa uga dadi target EcK2 sing disenengi.
Miturut analisis RNA-seq kita, EcK2 uga diekspresikan kanthi dhuwur ing LRT wanita prawan, ing ngendi dipateni sawise kawin (Gambar 2b). Kita ngonfirmasi data kasebut lan nemtokake manawa ekspresi EcK2 ora kena pengaruh saka asupan getih (Data Tambahan Gambar 5a). Ngembangake eksperimen MS awal kita, kita nemtokake manawa puncak 20E22P ana hubungane karo puncak 20E (22-26 jam sawise mangan getih; Data Tambahan Gambar 5b). Ngrendhem EcK2 ing wanita prawan nyebabake peningkatan 3 kali lipat ing rasio relatif 20E nganti 20E22P ing 26 jam sawise mangan getih (Gambar Data Tambahan 2c lan 5c), ngonfirmasi manawa EcK2 uga ngfosforilasi 20E ing wanita. Khususé, prawan sing kurang EcK2 njaga reseptivitas seksual lengkap (Data Tambahan Gambar 5d, e), luwih lanjut nuduhake manawa produksi 20E wanita ora nyebabake periode refraktori kawin. Nanging, wanita iki nduweni tingkat ngendhog sing tambah akeh dibandhingake karo kontrol, kanthi luwih saka 30% prawan ngendhog (Gambar Data Tambahan 5f). Yen injeksi RNA Eck2 untaian ganda (dsEcK2) ditindakake sawise menehi getih, pemijahan ora kedadeyan, ing titik kasebut puncak 20E amarga konsumsi getih wis mudhun. Sakabèhé, asil kasebut ndhukung model yen 20E sing diasilake sawise nyedhot getih bisa nyebabake pemijahan, nanging mung nalika blok pemijahan (EcK2 lan bisa uga faktor liyane) dipateni dening kawin. Injeksi 20E utawa 3D20E ora nyegah ekspresi EcK2 ing prawan (Gambar Data Tambahan 5g), sing nuduhake yen faktor liyane ngmediasi inhibisi kinase iki. Nanging, tingkat 20E sawise menehi getih ora cukup kanggo nyebabake rasa ora nyaman kawin, nanging kanthi efektif dipicu dening titer 3D20E sing ditransfer sacara seksual.
Asil panaliten iki menehi wawasan penting babagan mekanisme sing ngatur sukses reproduksi A. gambiae. Model wis muncul ing ngendi lanang wis berkembang kanggo nyintesis titer 3D20E sing dhuwur, ecdysone sing dimodifikasi khusus lanang sing njamin parentage kanthi nggawe wadon ora sensitif marang kawin luwih lanjut. Ing wektu sing padha, vektor malaria iki uga wis ngembangake sistem sing efisien kanggo ngaktifake 3D20E ing wadon minangka respon kanggo transfer seksual EPP khusus lanang. Kanggo kawruh kita, iki minangka conto pertama sistem hormon steroid sing didominasi lanang lan wadon sing nindakake fungsi unik lan kritis ing serangga. Fungsi ecdysone khusus lanang wis dipostulatake nanging durung didemonstrasikan kanthi definitif. Contone, hipotesis sing sebagian besar ora kabukten 18 yaiku fungsi kasebut bisa ditindakake dening prekursor 20E E1. Wis dingerteni manawa ing Drosophila, monandry dipicu dening transfer seksual peptida seks cilik 19,20 sing sesambungan karo neuron sing nginervasi saluran reproduksi wadon liwat reseptor peptida seks tartamtu 21,22. Karya luwih lanjut dibutuhake kanggo nemtokake sinyal hilir kaskade sing dikontrol dening 3D20E ing A. gambiae wadon lan kanggo nemtokake apa kaskade kasebut bisa dilestarikake antarane nyamuk lan Drosophila.
Amarga peran penting 3D20E ing kesuburan lan prilaku wanita sing diidentifikasi ing panliten kita, jalur sing ndadékaké sintesis lan aktivasi 3D20E nawakake kesempatan anyar kanggo strategi kontrol nyamuk ing mangsa ngarep, kayata generasi lanang steril kompetitif ing strategi teknologi serangga steril. Gunakake kanggo pelepasan liar utawa kanggo niru 3D20E ing dolanan prawan. Fungsi khusus lanang 3D20E bisa uga wis berkembang nalika A. gambiae lan spesies Cellia liyane entuk kemampuan kanggo ngoagulasi semen dadi colokan kawin, amarga iki ngidini transfer hormon lan enzim pengaktif hormon sing efisien. Sabanjure, evolusi 3D20E sing ngetrapake monandry nyedhiyakake mekanisme kanggo wadon (liwat ekspresi MISO sing dhuwur) kanggo ndhukung kebugaran reproduksi ing wilayah prevalensi malaria sing dhuwur, sing ora langsung nyumbang kanggo transmisi Plasmodium. Amarga 20E wadon wis dituduhake duwe efek sing jero babagan kaslametan lan pertumbuhan P. falciparum ing nyamuk Anopheles wadon,24 jalur hormon steroid lanang lan wadon saiki dadi aspek kunci interaksi nyamuk-parasit.
Galur A. gambiae G3 dikembangbiakake ing kahanan serangga standar (26-28 °C, kelembapan relatif 65-80%, fotoperiode padhang/peteng 12:12 jam). Larva diwenehi panganan iwak bubuk (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets lan Tetra Pond Sticks kanthi rasio 7:7:2). Lemut diwasa diwenehi larutan dekstrosa 10% ad libitum lan getih manungsa saben minggu (sinau komponen getih). Lemut prawan dipikolehi kanthi misahake jinis kelamin ing tahap pupa sawise mriksa pucuk kanthi mikroskop. Lanang sing nggawa transgen DsRed wis diterangake sadurunge.
Eksperimen kawin paksa ditindakake miturut protokol sing wis diterangake sadurunge. Kanggo kawin alami, wadon prawan umur 4 dina dijaga kanthi rasio 1:3 karo lanang prawan sing wis diwasa sacara seksual sajrone rong wengi. Kanggo eksperimen ing ngendi lanang disuntikake dsEPP, co-caging pas karo dina kaping 3-4 sawise injeksi, nalika aktivitas fosfatase dibungkem maksimal (Gambar Data Tambahan 2b).
Jaringan lemut, mayit sing isih ana (bagean awak liyane), utawa kabeh awak dibedah dadi metanol 100% lan dihomogenisasi nganggo beader (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Jumlah jaringan lan volume metanol kaya ing ngisor iki: awak liyane, 50 ing 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT wadon, 25–50 80 µl. Endapan kasebut diekstraksi metanol kaping pindho kanthi volume metanol sing padha. Lebu sel diilangi kanthi sentrifugasi. Metanol saka loro ekstraksi digabungake lan dikeringake ing aliran nitrogen, banjur disuspensi maneh ing volume 80% metanol ing banyu: awak liyane, 50 µl; MAG lan LRT wadon, 30 µl.
Sampel dianalisis nganggo spektrometer massa (ID-X, Thermo Fisher) sing dipasangake karo instrumen LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl sampel diinjeksi menyang kolom 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) sing dijaga ing suhu 25 °C. Fase gerak kanggo LC yaiku A (banyu, 0,1% asam format) lan B (asetonitril, 0,1% asam format). Gradien LC kaya ing ngisor iki: 5% B sajrone 1 menit, banjur tambah dadi 100% B sajrone 11 menit. Sawise 8 menit ing 100%, keseimbangan maneh kolom ing 5% B sajrone 4 menit. Laju aliran yaiku 0,3 ml min-1. Ionisasi ing sumber MS ditindakake kanthi ionisasi electrospray sing digawe panas ing mode positif lan negatif.
Spektrometer massa ngukur data ing kisaran m/z saka 350 nganti 680 kanthi resolusi 60.000 ing mode MS lengkap. Data MS/MS dipikolehi ing [M + H]+ (kabeh target), [M - H2O + H]+ (kabeh target), lan [M - H]- (target terfosforilasi). Data MS/MS digunakake kanggo ngonfirmasi sifat ekdysone target sing ora ana standar sing kasedhiya. Kanggo ngenali ekdysteroid sing ora ditarget, data MS/MS kanggo kabeh puncak HPLC kanthi kelimpahan relatif >15% dianalisis. Kuantifikasi nggunakake kurva standar sing digawe saka standar murni (20E, 3D20E) kanggo ngetung jumlah absolut utawa pengenceran saka siji sampel tartamtu (kabeh target liyane) kanggo ngetung padanan karo jumlah sing ditemokake ing siji lanang. Kanggo 3D20E, kuantifikasi ditindakake nggunakake jumlah saka adduct ing ngisor iki: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data diekstrak lan diukur nggunakake Tracefinder (versi 4.1). Data MS/MS dianalisis nggunakake Xcalibur (versi 4.4). Spektrum MS saka E, 20E lan 3D20E dibandhingake karo standar masing-masing. 3D20E22P dianalisis kanthi derivatisasi nganggo reagen Girard. 20E22P dianalisis kanthi rasio m/z.
3D20E22P dimurnèkaké saka MAG. Pemurnian ditindakake ing skala analitik nggunakake kromatografi cair kinerja ultra (Acquity, Waters) kanthi detektor berbasis massa quadrupole (QDa, Acquity, Waters) ing kondisi LC sing padha karo analisis HPLC-MS/MS. Pengumpulan fraksi dipicu nalika m/z sing cocog karo 3D20E22P dideteksi ing wektu retensi sing padha karo sing ditemtokake sadurunge. Kemurnian senyawa sing diekstrak banjur dicenthang dening HPLC-MS/MS kaya sing diterangake ing ndhuwur.
RNA total diekstrak saka 10-12 jaringan reproduksi utawa bagean awak liyane (tanpa sirah) nggunakake reagen TRI (Thermo Fisher) miturut pandhuan pabrikan. RNA diobati nganggo TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA disintesis nggunakake Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) miturut pandhuan pabrikan. Primer kanggo PCR kuantitatif transkripsi terbalik (RT-qPCR; Tabel Data Tambahan 2) sadurunge diterbitake24 utawa dirancang nggunakake Primer-BLAST26, kanthi preferensi diwenehake kanggo produk kanthi ukuran 70-150 bp lan nyakup sambungan ekson-ekson utawa primer pasangan Primer sing misahake ekson. Sampel cDNA saka telu nganti papat replika biologis diencerake kaping papat ing banyu kanggo RT-qPCR. Kuantifikasi ditindakake ing reaksi replika 15 µl sing ngemot 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer, lan 5 µl cDNA sing diencerake. Reaksi ditindakake ing QuantStudio 6 Pro Sistem PCR wektu nyata (Thermo Fisher) lan data dikumpulake lan dianalisis nggunakake Desain lan Analisis (versi 2.4.3). Kaya sing dituduhake ing panliten iki, jumlah relatif dinormalisasi menyang gen ribosom RpL19 (AGAP004422), sing ekspresine ora owah sacara signifikan karo pemberian getih 27 utawa kawin 3.
Kualitas RNA dicek nggunakake Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Pustaka Illumina sing dipasangake wis disiapake lan dilakokake ing Broad Institute of MIT lan Harvard. Pembacaan sekuensing diselarasake karo genom A. gambiae (galur PEST, versi 4.12) nggunakake HISAT2 (versi 2.0.5) kanthi parameter standar. Pembacaan kanthi skor kualitas pemetaan (MAPQ) <30 dibusak nggunakake Samtools (versi 1.3.1). Jumlah pembacaan sing dipetakan menyang gen diitung nggunakake htseq-count (versi 0.9.1) kanthi parameter standar. Jumlah pembacaan sing dinormalisasi diitung lan ekspresi gen diferensial dianalisis nggunakake paket DESeq2 (versi 1.28.1) ing R (versi 4.0.3).
Calon gen sing ngowahi Ecdysone diidentifikasi kanthi nggoleki genom A. gambiae nggunakake algoritma PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), nggunakake nilai standar Parameter kanthi urutan protein query ing ngisor iki: saka Bombyx mori (Nomer Aksesi NP_001038956.1), Musca domestica (Nomer Aksesi XP_005182020.1, XP_005175332.1 lan XP_011294434.1) lan Microplitis demolitor (Nomer Aksesi XP_008552646.1 lan XP_008552645.1) EcK saka B. mori (Nomer Aksesi NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nomer Aksesi NP_651202), Apis mellifera (Nomer Aksesi XP_394838) lan Acyrthosiphon pisum (Nomer Aksesi XP_001947166); lan EPP saka B. mori (Nomer Aksesi XP_001947166) NP_001177919.1 lan NP_001243996.1) lan EO saka D. melanogaster (Nomer Aksesi NP_572986.1) (langkah 1). Sabanjure, filter hits adhedhasar ekspresi mRNA sing dhuwur (>100 fragmen/kilobase ekson saben yuta maca sing dipetakan (FPKM) utawa >85%) ing jaringan reproduksi (LRT wadon utawa MAG) ing Gambia (langkah 2). Kanggo ningkatake spesifisitas, kita milih enzim kandidat sing uga diekspresikan ing jaringan reproduksi A. albimanus, spesies anopheles sing ora nyintesis utawa nransfer ecdysone sajrone kawin. Gen kandidat disaring adhedhasar ekspresi sing kurang (<100 FPKM utawa <85 persentil) ing jaringan reproduksi A. albimanus (langkah 3). Minangka filter pungkasan (langkah 4), gen kandidat kudu nyukupi paling ora salah siji saka ing ngisor iki: (1) regulasi sing signifikan sawise kawin (P <0,05) miturut analisis gen sing diekspresikan kanthi beda lan (2) ing jaringan non-reproduksi (<85% utawa <100 FPKM).
Kita ngowahi metode sing wis diterangake sadurunge 28, 29, 30 kanggo entuk pelabelan isotop organisme sakabèhé. Cekakipun, Saccharomyces cerevisiae tipe II tipe liar (YSC2, Sigma) diuji ing basa nitrogen ragi (BD Difco, DF0335) sing ngandhut (wt/vol) 2% glukosa (G7528, Sigma), 1,7% bebas asam amino lan amonium sulfat (medium kultur) lan 5% 15N amonium sulfat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) minangka siji-sijine sumber nitrogen. Ragi dijupuk kanthi sentrifugasi lan larva nyamuk diwenehi panganan ad libitum nganti pupation. Suplemen karo tepung iwak (0,5 mg saben 300 larva) kanggo nyegah kematian instar kaping papat. Mung wadon sing banjur digunakake ing eksperimen kawin karo lanang sing ora diwenehi label kanggo nganalisis proteom lanang sing ditransfer sajrone kawin.
Wadon prawan umur 4-6 dina sing diwenehi tag 15N dipeksa kawin karo lanang prawan sing durung diwenehi tag sing padha umure. Kawin sing sukses diverifikasi kanthi ndeteksi colokan kawin ing mikroskop epifluoresensi. Kanthi kecepatan 3, 12, lan 24 hpm, atrium 45-55 wadon sing kawin dibedah dadi 50 µl buffer amonium bikarbonat (pH 7,8) lan dihomogenisasi nganggo alu. Homogenat disentrifugasi lan supernatan dicampur karo 50 µl RapiGest 0,1% (186001860, Waters) ing 50 mM amonium bikarbonat. Supernatan lan pelet saka saben sampel dibekukan ing es garing lan dikirim sewengi menyang laboratorium MacCoss ing Universitas Washington, ing ngendi persiapan sampel kanggo LC-MS/MS rampung. Suspensi maneh pelet ing 50 µl RapiGest 0,1% ing 50 mM amonium bikarbonat lan Sonikasi ing bak banyu. Konsentrasi protein pelet lan supernatan diukur nganggo uji BCA, sampel direduksi nganggo 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), dialkilasi nganggo 15 mM iodoacetamide (Sigma) lan diinkubasi ing suhu 37 °C (1:0 50) sajrone 1 jam nganggo tripsinisasi: rasio tripsin:substrat). RapiGest dilisis kanthi tambahan 200 mM HCl, banjur inkubasi ing suhu 37 °C sajrone 45 menit lan sentrifugasi kanthi kecepatan 14.000 rpm sajrone 10 menit ing suhu 4 °C kanggo mbusak lebu. Sampel dicuci nganggo ekstraksi fase padat mode ganda (kartrid Oasis MCX, Waters) lan disuspensi maneh ing asam format 0,1% kanggo konsentrasi protein pungkasan 0,33 µg µl-1. Proteom MAG sing ora diwenehi label dianalisis kanthi cara sing padha saka lanang prawan. Rong replikasi analitis dianalisis kanggo saben Salajengipun, 1 µg saben sampel dianalisis ngginakaken kolom silika leburan 25 cm 75 μm kanthi jebakan frit Kasil1 (PQ) silika leburan 4 cm ingkang dipunkemas kaliyan resin fase terbalik Jupiter C12 (Phenomenex) lan kromatografi cair 180 menit. Intisari conto – MS/MS dilakokake ing spektrometer massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) nganggo Sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Data akuisisi sing ana gandhengane karo data sing digawe kanggo saben proses diowahi dadi format mzML nggunakake Proteowizard (versi 3.0.20287) lan nggunakake Comet31 (versi 3.2) nglawan basis data FASTA sing ngemot urutan protein saka Anopheles gambiae (VectorBase versi 54), Anopheles coluzzi. Panelusuran ditindakake ing Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maret 2021), A. gambiae RNA-seq, lan terjemahan telung pigura saka kontaminan manungsa sing dikenal. FDR sing cocog karo peta peptida ditemtokake nggunakake Percolator32 (versi 3.05) kanthi ambang 0,01, lan peptida dirakit dadi identifikasi protein nggunakake parsimoni protein ing Limelight33 (versi 2.2.0). Kelimpahan protein relatif diestimasikake nggunakake faktor kelimpahan spektral normalisasi (NSAF) sing diitung kanggo saben protein ing saben proses kaya sing diterangake sadurunge. NSAF relatif marang saben protein dirata-rata ing sampel saka rong replikasi biologis sing beda. Pelabelan 15N kasil nutupi proteom wadon, sanajan jumlah protein sing ora diwenehi label bisa dideteksi saka prawan sing diwenehi label. Kita nyathet deteksi reduksi protein lanang (1-5 spektrum) ing sampel mentah wadon mung ing proses teknis, ing ngendi sampel mentah ditindakake sawise sampel lanang/kawin, minangka asil saka HPLC "dibawa". Protein sok-sok ditemokake minangka 'kontaminan' saka prawan sing diwenehi label kadhaptar ing Tabel Tambahan 1.
Rong peptida antigenik, QTTDRVAPAPDQQQ (ing njero isotipe PA) lan MESDGTTPSGDSEQ (ing njero isotipe PA lan PB) ing Genscript. Rong peptida kasebut digabungake, banjur dikonjugasi karo protein pembawa KLH lan diinjeksi menyang terwelu Selandia Baru. Terwelu kasebut dikorbanake sawise injeksi kaping papat, lan total IgG diisolasi kanthi pemurnian afinitas. IgG saka terwelu sing paling spesifik EPP digunakake kanggo western blotting luwih lanjut.
Kanggo western blots, MAG (n = 10, ing ngendi n makili jumlah sampel nyamuk sing ora gumantung sacara biologis) lan LRT wadon (n = 30) saka lanang prawan umur 4 dina lan wadon prawan utawa sing dikawinke kanthi paksa (<10 sawise kawin), Buffer ekstraksi protein (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × koktail inhibitor protease (Roche)) ditambahake kanthi kapisah. Sampel dihomogenisasi langsung sawise dibedah nganggo beader (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Lebu sing ora larut dicopot kanthi sentrifugasi ing 20.000 g ing suhu 4 °C. Protein diukur kanthi Bradford assay (Bio-Rad). Banjur, 20 µg protein MAG, 40 µg protein LRT, lan 20 µg protein massal residual diisolasi. didenaturasi lan dipisahake nganggo 10% Bis-Tris NuPAGE nggunakake buffer MOPS. Protein ditransfer menyang membran polivinilidena fluorida nggunakake sistem transfer iBlot2 (Thermo Fisher). Membran dicuci kaping pindho ing 1 × PBS-T (0,1% Tween-20 ing PBS) banjur diblokir ing buffer pamblokiran Odyssey (Li-Cor) sajrone 1 jam ing suhu 22°C. Membran digoyang sewengi ing suhu 4°C nganggo antibodi primer poliklonal anti-EPP terwelu khusus (1:700 ing buffer pamblokiran) lan antibodi primer monoklonal anti-aktin tikus MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membran dicuci nganggo PBS-T banjur diinkubasi karo antibodi sekunder (anti-terwelu keledai 800CW lan anti-tikus wedhus 680LT (Li-Cor), loro-lorone 1:20.000) ing buffer pamblokiran sing ngemot 0,01% SDS lan 0,2% Tween -20 sajrone 1 jam ing 22 °C. Membran dikumbah nganggo PBS-T lan dicitra nganggo pemindai Odyssey CLx. Gambar dikumpulake lan diproses ing Image Studio (versi 5.2). Pita tartamtu sing cocog karo isoform EPP-RA (82 kDa) ora dideteksi.
Wilayah pengkodean EPP (minangka isoform AGAP002463-RB sing ngemot domain histidin fosfatase, panelusuran domain lestari NCBI 34) lan EcK2 (AGAP002181) diklon menyang plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Primer kadhaptar ing Tabel Data Tambahan 2. Wolung penghubung GS4 (bebarengan) dilebokake sadurunge tag C-terminal 6xHis saka konstruksi pET-21a(+)-EcK2. Protein rekombinan diprodhuksi nggunakake reaksi sintesis protein E. coli bebas sel NEBExpress (New England BioLabs). Protein rekombinan dimurnèkaké nggunakake kolom spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Protein kontrol dihidrofolat reduktase (DHFR) diprodhuksi nggunakake cithakan DNA saka Kit Sintesis Protein E. coli Bebas Sel NEBExpress. Protein disimpen ing 50% gliserol ing PBS ing suhu -20 °C nganti 3 sasi.
Aktivitas fosfatase saka EPP lan ekstrak jaringan diukur nggunakake 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Buffer reaksi ngandhut 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, lan 1 mM DTT. Jaringan dihomogenisasi ing buffer reaksi lan lebu sel diilangi kanthi sentrifugasi. Miwiti reaksi kanthi nambahake enzim utawa ekstrak jaringan menyang buffer reaksi sing ngandhut 2,5 mg ml-1 pNPP. Campuran reaksi diinkubasi ing suhu kamar ing peteng, lan jumlah pNP sing diowahi saka pNPP diukur kanthi ngukur absorbansi ing 405 nm ing macem-macem wektu.
Kanggo aktivitas EcK in vitro, protein kasebut diinkubasi karo 0,2 mg 20E utawa 3D20E ing 200 µl buffer (pH 7,5) sing ngemot 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP lan 10 mM MgCl2 sajrone 2 jam ing suhu 27 °C. Reaksi kasebut dihentikan kanthi nambahake 800 µl metanol, banjur didinginkan ing -20 °C sajrone 1 jam, banjur disentrifugasi ing 20.000 g sajrone 10 menit ing suhu 4 °C. Supernatan kasebut banjur dianalisis nganggo HPLC-MS/MS. Kanggo nginaktivasi protein sing digunakake ing klompok kontrol kanthi panas, protein kasebut diinkubasi ing 50% gliserol ing PBS sajrone 20 menit ing suhu 95 °C.
Kanggo aktivitas EPP in vitro, protein kasebut diinkubasi karo 3D20E22P (padha karo jumlah sing ditemokake ing 18 pasang MAG, sing dimurnèkaké nganggo HPLC-MS/MS) ing 100 µl buffer (pH 7,5) sing ngandhut 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, lan 1 mM DTT sajrone 3 jam ing suhu 27 °C. Reaksi kasebut dihentikan kanthi nambahake 400 µl metanol lan didinginkan ing -20 °C sajrone 1 jam, banjur disentrifugasi ing 20.000 g sajrone 10 menit ing suhu 4 °C. Supernatan dianalisis nganggo HPLC-MS/MS.
Fragmen PCR kanggo EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) lan EcK2 (556 bp) diamplifikasi saka cDNA sing disiapake saka mayit nyamuk tanpa sirah campuran jenis kelamin. Fragmen PCR saka kontrol eGFP (495 bp) diamplifikasi saka pCR2.1-eGFP sing diterangake sadurunge; Primer PCR kadhaptar ing Tabel Data Tambahan 2. Fragmen PCR dilebokake ing antarane promotor T7 sing diwalik ing plasmid pL4440. Konstruk plasmid dijupuk saka E. coli kompeten NEB 5-α (New England Biolabs) lan diverifikasi kanthi sekuensing DNA sadurunge digunakake (waca Data Tambahan 1 kanggo urutan sisipan). Primer sing cocog karo promotor T7 (Tabel Data Tambahan 2) digunakake kanggo nggedhekake sisipan saka plasmid berbasis pL4440. Ukuran produk PCR dikonfirmasi kanthi elektroforesis gel agarose. RNA ds ditranskripsi saka cithakan PCR nggunakake Kit Transkripsi Megascript T7 (Thermo Fisher) lan dimurnèkaké miturut pandhuan pabrikan kanthi modifikasi sing diterangake sadurunge.
Kanggo injeksi dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) diinjeksi kanthi konsentrasi 10 ng nl-1 menyang thorax lanang utawa wadon diwasa (Nanoject III, Drummond) sajrone 1 dina sawise eklosi. Tingkat knockdown gen ditemtokake ing paling ora telung replikasi biologis kanthi ekstraksi RNA, sintesis cDNA, lan RT-qPCR. Kanggo injeksi ecdysone, wadon prawan umur 4 dina utawa prawan umur 6 dina sing diwenehi getih diinjeksi nganggo 0,13, 0,21, utawa 0,63 µg 20E utawa 3D20E (Nanoject III, Drummond) kanthi konsentrasi 1,3, 2,1, gumantung saka desain eksperimen utawa 6,3 ng nl-1. Injeksi 100 nl etanol 10% (vol/vol) ing banyu; 100 nl 3D20E22P ing 10% etanol (padha karo 75% saka jumlah sing ditemokake ing sepasang MAG). Lemut diundi kanthi acak menyang klompok injeksi.
Kanggo uji pemijahan, lemut wadon umur 3 dina diwenehi getih manungsa kanthi ad libitum. Copot lemut sing diwenehi panganan sebagian utawa sing ora diwenehi panganan. Gumantung saka perawatan, lemut wadon dilebokake ing cangkir pemijahan sing kapisah sajrone patang wengi paling ora 48 jam sawise mangan getih. Endhog diitung nganggo stereoskop (Stemi 508, Zeiss); kanggo lemut wadon sing kawin, endhog sing netes dadi larva dianggep subur.
Kanggo uji coba kawin, wadon diwenehi wektu paling ora 2 dina gumantung saka perawatan kanggo ngembangake resistensi kawin, lan lanang sing cocog karo umur tipe liar banjur dilebokake ing kandhang sing padha. Rong wengi sabanjure, vesikel wadon sing dibuahi dibedah lan DNA genomik dirilis kanthi pembekuan-pencairan lan sonikasi ing buffer sing ngemot 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, lan 25 mM NaCl (pH 8.2). Sampel diinkubasi karo Proteinase K (0.86 µg µl-1) sajrone 15 menit ing suhu 55 °C, banjur 10 menit ing suhu 95 °C. Preparat DNA genomik mentah diencerke 10 kali lipat lan dideteksi qPCR saka urutan kromosom Y; primer kadhaptar ing Tabel Data Tambahan 2. Ora ana urutan kromosom Y nuduhake ora ana kawin.
Kanggo uji kawin maneh, betina sing kawin paksa ditliti kanggo anane colokan kawin kanggo ngonfirmasi status kawin lan diwenehi wektu 2 dina kanggo ngembangake refraktori kanggo kawin tanpa ana betina, kaya sing wis diterangake sadurunge 36. Lanang sing nggawa sperma transgenik DsRed banjur dilebokake ing kandhang betina. Rong wengi sabanjure, vesikel sing dibuahi dibedah saka betina, lan DNA genomik disiapake kaya sing diterangake ing ndhuwur lan ditindakake deteksi qPCR saka transgen DsRed; primer kadhaptar ing Tabel Data Tambahan 2. Anane transgen DsRed nuduhake yen ora ana kawin maneh sing kedadeyan.
3D20E disintesis kaya sing wis diterangake sadurunge 37. Cekakipun, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) dilarutake ing 10 ml banyu, banjur ditambah 30 mg platinum black (ing bentuk bubuk, Sigma-Aldrich). Aliran O2 sing alus terus diwutahake menyang campuran reaksi, sing diudhek ing suhu kamar. Sawise 6 jam, 30 mL metanol ditambahake kanggo mungkasi reaksi. Campuran kasebut disentrifugasi kanggo mbusak partikel katalis. Supernatan diuapke nganti garing ing vakum ing suhu kamar. Produk reaksi sing garing dilarutake ing 10% etanol lan metanol kanggo injeksi kanggo analisis HPLC-MS/MS. Tingkat konversi (saka 20E dadi 3D20E) kira-kira 97% (Gambar 4b), lan spektrum MS saka 3D20E sing disintesis cocog karo sing ditemokake ing wadon sing dikawinke (Gambar 4c).
Legenda iki ngemot rincian spesifik saka tes statistik sing ditindakake. GraphPad (versi 9.0) digunakake kanggo nindakake tes eksak Fisher, tes Mantel-Cox, lan uji-t Student. Tes Cochran-Mantel-Haenszel ditindakake nggunakake skrip R khusus (kasedhiya ing https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Distribusi data diuji normalitas nggunakake tes Shapiro-Wilk kanthi ambang signifikansi 0,05. Nalika data gagal tes normalitas, tes Mann-Whitney ditindakake. Data kaslametan dianalisis nggunakake tes Mantel-Cox. Paket DESeq2 (versi 1.28.1) digunakake kanggo nindakake analisis ekspresi diferensial tingkat gen RNA-seq. Bilah horisontal ing grafik makili median. Nilai signifikansi P = 0,05 digunakake minangka ambang kanggo kabeh tes.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain panliten, deleng abstrak Laporan Riset Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.
Data proteomik MS disimpen ing Konsorsium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) liwat Repositori Mitra PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) nganggo pengenal set data PXD032157.
Dataset RNA-seq disimpen ing Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ing sangisore rekaman serial GSE198665.
Kumpulan data tambahan sing digawe lan/utawa dianalisis sajrone panliten saiki bisa dipikolehi saka penulis sing cocog yen ana panyuwunan sing cukup. Artikel iki nyedhiyakake data sumber.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid seks serangga sing diabaikan? Lanang: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone lan perkembangan ovarium ing Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).