Metabolit imunomodulator minangka fitur utama saka lingkungan mikro tumor (TME), nanging kanthi sawetara pangecualian, identitas kasebut isih durung dingerteni. Ing kene, kita nganalisa tumor lan sel T saka tumor lan asites pasien karsinoma serosa tingkat tinggi (HGSC) kanggo mbukak metabolit saka kompartemen TME sing beda iki. Asites lan sel tumor duwe beda metabolit sing ekstensif. Dibandhingake karo asites, sel T sing nyusup tumor luwih akeh kandungan 1-metilnikotinamida (MNA). Sanajan tingkat MNA ing sel T mundhak, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim sing ngkatalisis transfer gugus metil saka S-adenosilmetionin dadi nikotinamida) diwatesi mung kanggo fibroblas lan sel tumor. Sacara fungsional, MNA ngindhuksi sel T kanggo ngetokake sitokin faktor nekrosis tumor alpha sing ningkatake tumor. Mulane, MNA sing asale saka TME nyumbang kanggo regulasi kekebalan sel T lan minangka target imunoterapi potensial kanggo perawatan kanker manungsa.
Metabolit sing asale saka tumor bisa nduweni efek inhibisi sing jero marang kekebalan anti-tumor, lan saya akeh bukti sing nuduhake yen dheweke uga bisa dadi kekuatan pendorong utama kanggo perkembangan penyakit (1). Saliyane efek Warburg, riset anyar wis diwiwiti kanggo njlentrehake kahanan metabolisme sel tumor lan hubungane karo kahanan kekebalan lingkungan mikro tumor (TME). Panliten babagan model tikus lan sel T manungsa wis nuduhake yen metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) lan metabolisme glukosa (4) bisa tumindak kanthi mandiri ing macem-macem subkelompok sel imun. Sawetara metabolit ing jalur kasebut nyegah fungsi anti-tumor sel T. Wis kabukten yen blokade koenzim tetrahydrobiopterin (BH4) bisa ngrusak proliferasi sel T, lan paningkatan BH4 ing awak bisa nambah respon imun anti-tumor sing dimediasi dening CD4 lan CD8. Kajaba iku, efek imunosupresif kynurenine bisa dislametake kanthi administrasi BH4 (5). Ing glioblastoma mutan isocitrate dehydrogenase (IDH), sekresi enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) nyegah aktivasi, proliferasi, lan Aktivitas sitolisis sel T (6). Bubar iki, wis dituduhake yen metilglyoxal, produk sampingan saka glikolisis, diprodhuksi dening sel supresor asal myeloid, lan transfer sel T saka metilglyoxal bisa nyegah fungsi sel T efektor. Ing perawatan, netralisasi metilglyoxal bisa ngatasi aktivitas sel supresor sing asale saka myeloid (MDSC) lan sacara sinergis ningkatake terapi blokade checkpoint ing model tikus (7). Panliten kasebut kanthi kolektif nandheske peran kunci metabolit sing asale saka TME ing ngatur fungsi lan aktivitas sel T.
Disfungsi sel T wis akeh dilapurake ing kanker ovarium (8). Iki sebagian amarga karakteristik metabolisme sing ana ing hipoksia lan vaskularisasi tumor sing ora normal (9), sing nyebabake konversi glukosa lan triptofan dadi produk sampingan kayata asam laktat lan kynurenine. Laktat ekstraseluler sing berlebihan nyuda produksi interferon-γ (IFN-γ) lan ndorong diferensiasi subkelompok myelosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan langsung nyegah proliferasi sel T lan nyegah sinyal reseptor sel T (12-14). Senadyan pengamatan kasebut, akeh karya sing ana gandhengane karo metabolisme kekebalan sing ditindakake ing kultur sel T in vitro nggunakake media sing dioptimalake, utawa diwatesi ing model tikus homolog in vivo, sing ora nggambarake heterogenitas kanker manungsa lan lingkungan makro lan mikro fisiologis.
Fitur umum kanker ovarium yaiku panyebaran peritoneal lan munculé asites. Akumulasi cairan sel ing asites digandhengake karo penyakit lanjut lan prognosis sing kurang apik (15). Miturut laporan, kompartemen unik iki hipoksia, nduweni tingkat faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) lan indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) sing dhuwur, lan disusupi dening sel pengatur T lan sel penghambat myeloid (15-18). Lingkungan metabolisme asites bisa uga beda karo tumor kasebut dhewe, mula pemrograman ulang sel T ing ruang peritoneal ora jelas. Kajaba iku, bedane utama lan heterogenitas antarane asites lan metabolit sing ana ing lingkungan tumor bisa ngalangi infiltrasi sel imun lan fungsine ing tumor, lan riset luwih lanjut dibutuhake.
Kanggo ngatasi masalah kasebut, kita ngrancang metode pamisahan sel sensitif lan kromatografi cair spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) kanggo nyinaoni macem-macem jinis sel (kalebu sel CD4+ lan CD8+) uga ing njero lan antarane tumor. Metabolit kasebut ngliwati sel ing asites lan lingkungan tumor sing padha karo pasien. Kita nggunakake metode iki bebarengan karo sitometri aliran dimensi dhuwur lan sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq) kanggo menehi potret status metabolisme populasi kunci iki kanthi jelas. Metode iki nuduhake peningkatan sing signifikan ing tingkat 1-metilnikotinamida (MNA) ing sel T tumor, lan eksperimen in vitro nuduhake yen efek imunomodulator MNA ing fungsi sel T sadurunge ora dingerteni. Umumé, metode iki nuduhake interaksi metabolisme timbal balik antarane tumor lan sel kekebalan, lan menehi wawasan unik babagan metabolit regulasi kekebalan, sing bisa migunani kanggo perawatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T.
Kita nggunakake sitometri aliran dimensi dhuwur kanggo ngukur serapan glukosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukosa (2-NBDG) lan aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) minangka penanda khas sing mbedakake sel imun lan populasi sel tumor (Tabel S2 lan Gambar S1A). Analisis iki nuduhake yen dibandhingake karo sel T, asites lan sel tumor duwe tingkat serapan glukosa sing luwih dhuwur, nanging duwe bedane sing luwih cilik ing aktivitas mitokondria. Serapan glukosa rata-rata sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] telu nganti papat kali lipat saka sel T, lan serapan glukosa rata-rata sel T CD4 + yaiku 1,2 kali lipat saka sel T CD8 +, sing nuduhake limfosit infiltrasi tumor (TIL) duwe syarat metabolisme sing beda sanajan ing TME sing padha (Gambar 1A). Kosok baline, aktivitas mitokondria ing sel tumor padha karo sel CD4 + T, lan aktivitas mitokondria saka kaloro jinis sel kasebut luwih dhuwur tinimbang sel CD8 + T (Gambar 1B). Umumé, asil kasebut nuduhake tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor luwih dhuwur tinimbang sel CD4 + T, lan aktivitas metabolisme sel CD4 + T luwih dhuwur tinimbang sel CD8 + T. Senadyan efek kasebut ing antarane jinis sel, ora ana bedane sing konsisten ing status metabolisme sel CD4 + lan CD8 + T utawa proporsi relatif ing asites dibandhingake karo tumor (Gambar 1C). Kosok baline, ing fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM + ing tumor mundhak dibandhingake karo asites (Gambar 1D). Kita uga mirsani bedane metabolisme sing jelas antarane komponen sel EpCAM + lan EpCAM-. Sel EpCAM + (tumor) duwe penyerapan glukosa lan aktivitas mitokondria sing luwih dhuwur tinimbang sel EpCAM-, sing luwih dhuwur tinimbang aktivitas metabolisme fibroblas ing sel tumor ing TME (Gambar 1, E lan F).
(A lan B) Intensitas fluoresensi median (MFI) saka serapan glukosa (2-NBDG) (A) lan aktivitas mitokondria sel T CD4 + (MitoTracker abang peteng) (B) Grafik representatif (kiwa) lan data tabulasi (Tengen), sel T CD8 + lan sel tumor EpCAM + CD45 saka asites lan tumor. (C) Rasio sel CD4 + lan CD8 + (saka sel T CD3 +) ing asites lan tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + ing asites lan tumor (CD45−). (E lan F) Serapan glukosa EpCAM + tumor CD45 lan matriks EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) lan aktivitas mitokondria (MitoTracker abang peteng) (F) grafik representatif (kiwa) lan data tabulasi (Tengen) Asites lan sel tumor. (G) Grafik representatif saka ekspresi CD25, CD137 lan PD1 kanthi flow cytometry. (H lan I) Ekspresi CD25, CD137 lan PD1 ing sel CD4 + T (H) lan sel CD8 + T (I). (J lan K) Fenotipe memori pusat (Tcm), efektor (Teff) lan memori efektor (Tem) sing naif adhedhasar ekspresi CCR7 lan CD45RO. Gambar representatif (kiwa) lan data tabular (tengen) sel CD4 + T (J) lan sel CD8 + T (K) ing asites lan tumor. Nilai P ditemtokake dening uji-t sing dipasangake (*P<0,05, **P<0,01 lan ***P<0,001). Garis kasebut makili pasien sing cocog (n = 6). FMO, fluoresensi minus siji; MFI, intensitas fluoresensi median.
Analisis luwih lanjut nuduhake bedane liyane sing signifikan antarane status fenotipik sel T sing wis dirampungake kanthi apik. Memori sing diaktifake (Gambar 1, G nganti I) lan efektor (Gambar 1, J lan K) ing tumor luwih kerep tinimbang asites (proporsi sel T CD3 +). Kajaba iku, nganalisa fenotipe kanthi ekspresi penanda aktivasi (CD25 lan CD137) lan penanda deplesi [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] nuduhake yen sanajan karakteristik metabolisme populasi kasebut beda (Gambar S1, B nganti E), nanging ora ana bedane metabolisme sing signifikan sing diamati kanthi konsisten antarane subkumpulan naif, efektor utawa memori (Gambar S1, F nganti I). Asil kasebut dikonfirmasi kanthi nggunakake metode pembelajaran mesin kanggo menehi fenotipe sel kanthi otomatis (21), sing luwih lanjut nuduhake anané akeh sel sumsum balung (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ing asites pasien (Gambar S2A). Saka kabeh jinis sel sing diidentifikasi, populasi sel myeloid iki nuduhake serapan glukosa lan aktivitas mitokondria paling dhuwur (Gambar S2, B nganti G). Asil kasebut nyoroti beda metabolisme sing kuwat antarane macem-macem jinis sel sing ditemokake ing asites lan tumor ing pasien HGSC.
Tantangan utama kanggo mangerteni karakteristik metabonomi TIL yaiku kabutuhan kanggo ngisolasi sampel sel T kanthi kemurnian, kualitas, lan kuantitas sing cukup saka tumor. Panliten anyar nuduhake yen metode pemilahan lan pengayaan manik adhedhasar sitometri aliran bisa nyebabake owah-owahan ing profil metabolit seluler (22-24). Kanggo ngatasi masalah iki, kita ngoptimalake metode pengayaan manik kanggo ngisolasi lan ngisolasi TIL saka kanker ovarium manungsa sing direseksi kanthi operasi sadurunge dianalisis dening LC-MS/MS (waca Bahan lan Metode; Gambar 2A). Kanggo netepake dampak sakabèhé saka protokol iki babagan owah-owahan metabolit, kita mbandhingake profil metabolit sel T sing diaktifake dening donor sehat sawise langkah pamisahan manik ing ndhuwur karo sel sing ora dipisahake manik nanging tetep ana ing es. Analisis kontrol kualitas iki nemokake yen ana korelasi sing dhuwur antarane rong kondisi kasebut (r = 0,77), lan pengulangan teknis saka klompok 86 metabolit duwe pengulangan sing dhuwur (Gambar 2B). Mulane, metode iki bisa nindakake analisis metabolit sing akurat ing sel sing ngalami pengayaan jinis sel, saengga nyedhiyakake platform resolusi dhuwur pisanan kanggo ngenali metabolit tartamtu ing HGSC, saengga wong bisa entuk pangerten sing luwih jero babagan spesifisitas sel. Program metabolisme Seksual.
(A) Diagram skematis pengayaan manik magnetik. Sadurunge dianalisis nganggo LC-MS/MS, sel-sel kasebut bakal ngalami telung babak pengayaan manik magnetik berturut-turut utawa tetep ana ing es. (B) Efek jinis pengayaan marang akehe metabolit. Rata-rata telung pangukuran kanggo saben jinis pengayaan ± SE. Garis abu-abu nggambarake hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) saka pangukuran bola-bali sing dituduhake ing label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematis alur kerja analisis metabolit pasien. Asites utawa tumor dikumpulake saka pasien lan dikriopreservasi. Sebagian cilik saka saben sampel dianalisis nganggo sitometri aliran, dene sampel sing isih ana ngalami telung babak pengayaan kanggo sel CD4+, CD8+ lan CD45-. Fraksi sel iki dianalisis nganggo LC-MS/MS. (D) Peta panas saka akehe metabolit standar. Dendrogram nggambarake kluster jarak Euclidean antarane sampel dening Ward. (E) Analisis komponen utama (PCA) saka peta metabolit sampel, sing nuduhake telung replikasi saben sampel, sampel saka pasien sing padha disambungake nganggo garis. (F) PCA saka profil metabolit sampel sing dikondisikake ing pasien (yaiku, nggunakake redundansi parsial); jinis sampel diwatesi dening lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Sabanjure, kita ngetrapake metode pengayaan iki kanggo nganalisis 99 metabolit ing fraksi sel CD4+, CD8+ lan CD45 ing asites lan tumor utama saka enem pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A lan Tabel S3 lan S4). Populasi sing diminati nyumbang 2% nganti 70% saka sampel gedhe asli sel urip, lan proporsi sel beda-beda banget antarane pasien. Sawise misahake manik-manik, fraksi sing diminati sing diperkaya (CD4+, CD8+ utawa CD45-) nyumbang luwih saka 85% saka kabeh sel urip ing sampel rata-rata. Metode pengayaan iki ngidini kita nganalisis populasi sel saka metabolisme jaringan tumor manungsa, sing ora bisa ditindakake saka sampel gedhe. Nggunakake protokol iki, kita nemtokake manawa l-kynurenine lan adenosin, loro metabolit imunosupresif sing ditondoi kanthi apik iki mundhak ing sel T tumor utawa sel tumor (Gambar S3, B lan C). Mulane, asil kasebut nduduhake kesetiaan lan kemampuan teknologi pamisahan sel lan spektrometri massa kanggo nemokake metabolit sing penting sacara biologis ing jaringan pasien.
Analisis kita uga nuduhake pamisahan metabolisme sing kuwat saka jinis sel ing njero lan antarane pasien (Gambar 2D lan Gambar S4A). Utamane, dibandhingake karo pasien liyane, pasien 70 nuduhake karakteristik metabolisme sing beda (Gambar 2E lan Gambar S4B), sing nuduhake yen ana heterogenitas metabolisme sing substansial antarane pasien. Perlu dicathet yen dibandhingake karo pasien liyane (1,2 nganti 2 liter; Tabel S1), jumlah total asites sing diklumpukake ing pasien 70 (80 ml) luwih cilik. Kontrol heterogenitas antar pasien sajrone analisis komponen utama (contone, nggunakake analisis redundansi parsial) nuduhake owah-owahan sing konsisten antarane jinis sel, lan jinis sel lan/utawa lingkungan mikro dikumpulake kanthi jelas miturut profil metabolit (Gambar 2F). Analisis metabolit tunggal nandheske efek kasebut lan nuduhake beda sing signifikan antarane jinis sel lan lingkungan mikro. Perlu dicathet yen bedane sing paling ekstrem sing diamati yaiku MNA, sing biasane diperkaya ing sel CD45- lan ing sel CD4+ lan CD8+ sing nyusup tumor (Gambar 3A). Kanggo sel CD4+, efek iki paling jelas, lan MNA ing sel CD8+ uga katon kena pengaruh banget dening lingkungan. Nanging, iki ora penting, amarga mung telu saka enem pasien sing bisa dievaluasi kanggo skor tumor CD8+. Saliyane MNA, ing macem-macem jinis sel ing asites lan tumor, metabolit liyane sing kurang dicirikake ing TIL uga sugih kanthi beda (Gambar S3 lan S4). Mulane, data iki nuduhake sakumpulan metabolit imunomodulator sing janjeni kanggo riset luwih lanjut.
(A) Isi MNA sing dinormalisasi ing sel CD4+, CD8+ lan CD45- saka asites lan tumor. Plot kothak nuduhake median (garis), rentang interkuartil (engsel pigura) lan rentang data, nganti 1,5 kali rentang interkuartil (kumis pigura). Kaya sing diterangake ing Bahan lan Metode Pasien, gunakake nilai limma pasien kanggo nemtokake nilai P (*P<0,05 lan **P<0,01). (B) Diagram skematis metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (ijo): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE saka scRNA-seq saka asites (abu-abu) lan tumor (abang; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT ing populasi sel sing beda-beda sing diidentifikasi nggunakake scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT lan AOX1 ing SK-OV-3, ginjel embrio manungsa (HEK) 293T, sel T lan sel T sing diobati MNA. Ekspresi lipatan dituduhake relatif marang SK-OV-3. Pola ekspresi karo SEM dituduhake (n = 6 donor sehat). Nilai Ct luwih saka 35 dianggep ora bisa dideteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 lan SLC22A2 ing SK-OV-3, HEK293T, sel T lan sel T sing diobati nganggo 8mM MNA. Ekspresi sing dilipat dituduhake relatif marang SK-OV-3. Pola ekspresi karo SEM dituduhake (n = 6 donor sehat). Nilai Ct sing luwih gedhe saka 35 dianggep ora bisa dideteksi (UD). (G) Isi MNA sel ing sel T donor sehat sing diaktifake sawise 72 jam inkubasi karo MNA. Pola ekspresi karo SEM dituduhake (n = 4 donor sehat).
MNA diprodhuksi kanthi nransfer gugus metil saka S-adenosil-1-metionin (SAM) menyang nikotinamida (NA) dening nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresikan kanthi berlebihan ing macem-macem kanker manungsa lan ana gandhengane karo proliferasi, invasi lan metastasis (25-27). Kanggo luwih ngerti sumber MNA ing sel T ing TME, kita nggunakake scRNA-seq kanggo menehi ciri ekspresi NNMT ing antarane jinis sel ing asites lan tumor saka telung pasien HGSC (Tabel S5). Analisis kira-kira 6.500 sel nuduhake yen ing asites lan lingkungan tumor, ekspresi NNMT diwatesi ing populasi sel fibroblas lan tumor sing dianggep (Gambar 3, C lan D). Perlu dicathet yen ora ana ekspresi NNMT sing jelas ing populasi apa wae sing ngekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D lan Gambar S5A), sing nuduhake yen MNA sing dideteksi ing spektrum metabolit wis dikenalake menyang sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) ngowahi MNA dadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) utawa 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) uga diwatesi ing populasi fibroblas sing ngekspresikake COL1A1 (Gambar S5A), sing bebarengan nuduhake yen sel T ora duwe kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen sing ana gandhengane karo MNA iki diverifikasi nggunakake set data sel independen kapindho saka asites saka pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Kajaba iku, analisis reaksi rantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor sehat sing diobati nganggo MNA nuduhake yen dibandhingake karo sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT utawa AOX1 meh ora diekspresikan (Gambar 3E). Asil sing ora dikarepke iki nuduhake yen MNA bisa disekresi saka fibroblas utawa tumor menyang sel T sing jejer ing TME.
Senajan calon kalebu kulawarga transporter kation organik 1 nganti 3 (OCT1, OCT2 lan OCT3) sing dikodekake dening kulawarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 lan SLC22A3), transporter potensial MNA isih durung ditemtokake (28). QPCR mRNA saka sel T donor sing sehat nuduhake tingkat ekspresi SLC22A1 sing kurang nanging tingkat SLC22A2 sing ora bisa dideteksi, sing ngonfirmasi manawa wis dilapurake sadurunge ing literatur (Gambar 3F) (29). Kosok baline, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 ngekspresikake tingkat dhuwur saka loro transporter kasebut (Gambar 3F).
Kanggo nguji kemungkinan sel T sing nduweni kemampuan kanggo nyerep MNA asing, sel T donor sing sehat dikultur sajrone 72 jam kanthi konsentrasi MNA sing beda-beda. Tanpa anané MNA eksogen, isi seluler MNA ora bisa dideteksi (Gambar 3G). Nanging, sel T sing diaktifake sing diobati nganggo MNA eksogen nuduhake peningkatan isi MNA sing gumantung dosis ing sel, nganti 6 mM MNA (Gambar 3G). Asil iki nuduhake yen sanajan tingkat ekspresi transporter sing kurang lan ora ana enzim utama sing tanggung jawab kanggo metabolisme MNA intraseluler, TIL isih bisa nyerep MNA.
Spektrum metabolit ing sel T pasien lan eksperimen penyerapan MNA in vitro nambah kemungkinan yen fibroblas sing ana gandhengane karo kanker (CAF) ngetokake MNA lan sel tumor bisa ngatur fenotipe lan fungsi TIL. Kanggo nemtokake efek MNA ing sel T, sel T donor sing sehat diaktifake in vitro nalika ana utawa ora ana MNA, lan proliferasi lan produksi sitokin dievaluasi. Sawise 7 dina nambahake MNA ing dosis paling dhuwur, jumlah populasi sing dobel rada suda, dene vigor tetep dijaga ing kabeh dosis (Gambar 4A). Kajaba iku, perawatan MNA eksogen nyebabake peningkatan proporsi sel T CD4 + lan CD8 + sing ngekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Kosok baline, produksi intraseluler IFN-γ suda sacara signifikan ing sel T CD4 +, nanging ora ing sel T CD8 +, lan ora ana owah-owahan sing signifikan ing interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C lan D). Mulane, uji coba imunosorben sing disambung enzim (ELISA) saka supernatan saka kultur sel T sing diobati MNA iki nuduhake peningkatan TNFα sing signifikan, penurunan IFN-γ, lan ora ana owah-owahan ing IL-2 (Gambar 4, E nganti G). Penurunan IFN-γ nuduhake yen MNA bisa uga nduweni peran kanggo nyegah aktivitas anti-tumor sel T. Kanggo simulasi efek MNA ing sitotoksisitas sing dimediasi sel T, sel reseptor antigen chimeric T (FRα-CAR-T) sing nargetake reseptor folat α lan CAR-T (GFP) sing diatur dening sel protein fluoresen ijo (GFP) -CAR-T) diprodhuksi dening sel mononuklear getih perifer donor sing sehat (PBMC). Sel CAR-T dikultur sajrone 24 jam ing ngarsane MNA, banjur dikultur bebarengan karo sel tumor ovarium SK-OV-3 manungsa sing ngekspresikan reseptor folat α kanthi rasio efektor karo target 10:1. Perawatan MNA nyebabake penurunan aktivitas mateni sel FRα-CAR-T sing signifikan, sing padha karo sel FRα-CAR-T sing diobati nganggo adenosin (Gambar 4H).
(A) Total cacah sel sing layak lan panggandaan populasi (PD) langsung saka kultur ing dina kaping 7. Grafik batang nggambarake rata-rata + SEM saka enem donor sing sehat. Nggambarake data saka paling ora n = 3 eksperimen independen. (B nganti D) CD3/CD28 lan IL-2 digunakake kanggo ngaktifake sel T ing konsentrasi MNA masing-masing sajrone 7 dina. Sadurunge analisis, sel distimulasi nganggo PMA/ionomisin nganggo GolgiStop sajrone 4 jam. Ekspresi TNFα (B) ing sel T. Conto gambar (kiwa) lan data tabular (tengen) ekspresi TNFα ing sel urip. Ekspresi IFN-γ (C) lan IL-2 (D) ing sel T. Ekspresi sitokin diukur nganggo sitometri aliran. Grafik batang nggambarake rata-rata (n = 6 donor sehat) + SEM. Gunakake analisis varians siji arah lan pangukuran bola-bali (*P<0,05 lan **P<0,01) kanggo nemtokake nilai P. Nggambarake data saka paling ora n = 3 eksperimen independen. (E nganti G) CD3/CD28 lan IL-2 digunakake kanggo ngaktifake sel T ing konsentrasi MNA masing-masing sajrone 7 dina. Medium kasebut dikumpulake sadurunge lan sawise 4 jam stimulasi PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) lan IL-2 (G) diukur nganggo ELISA. Grafik batang nggambarake rata-rata (n = 5 donor sehat) + SEM. Nilai P ditemtokake nggunakake analisis varians siji arah lan pangukuran bola-bali (*P<0,05). Garis putus-putus nuduhake watesan deteksi. (H) Uji lisis sel. Sel FRα-CAR-T utawa GFP-CAR-T diatur nganggo adenosin (250μM) utawa MNA (10 mM) sajrone 24 jam, utawa ora diobati (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 diukur. Nilai P ditemtokake nganggo uji t Welch (*P<0,5 lan **P<0,01).
Kanggo entuk pangerten mekanistik babagan regulasi ekspresi TNFα sing gumantung karo MNA, owah-owahan ing mRNA TNFα saka sel T sing diobati MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor sehat sing diobati nganggo MNA nuduhake peningkatan kaping pindho ing tingkat transkripsi TNFα, sing nuduhake yen MNA gumantung marang regulasi transkripsi TNFα. Kanggo nyelidiki mekanisme regulasi sing bisa ditindakake iki, rong faktor transkripsi sing dikenal sing ngatur TNFα, yaiku faktor nuklir sel T sing diaktifake (NFAT) lan protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi minangka respon kanggo ikatan MNA menyang promotor TNFα proksimal (30). Promotor TNFα ngemot 6 situs ikatan NFAT sing diidentifikasi lan 2 situs ikatan Sp1, tumpang tindih ing siji situs [-55 pasangan basa (bp) saka 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) nuduhake yen nalika diobati nganggo MNA, ikatan Sp1 menyang promotor TNFα mundhak kaping telu. Penggabungan NFAT uga mundhak lan nyedhaki pentinge (Gambar 5B). Data iki nuduhake yen MNA ngatur ekspresi TNFα liwat transkripsi Sp1, lan ing tingkat sing luwih sithik, ekspresi NFAT.
(A) Dibandhingake karo sel T sing dikultur tanpa MNA, owah-owahan lipatan ekspresi TNFα ing sel T sing diobati nganggo MNA. Pola ekspresi nganggo SEM dituduhake (n = 5 donor sehat). Nggambarake data saka paling ora n = 3 eksperimen independen. (B) Promotor TNFα sel T sing diobati nganggo utawa tanpa 8 mM MNA sawise NFAT lan Sp1 digabungake karo (Ctrl) lan stimulasi PMA/ionomisin sajrone 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) lan H3 digunakake minangka kontrol negatif lan positif kanggo imunopresipitasi. Kuantifikasi ChIP nuduhake yen pengikatan Sp1 lan NFAT menyang promotor TNFα ing sel sing diobati MNA mundhak kaping pirang-pirang dibandhingake karo kontrol. Nggambarake data saka paling ora n = 3 eksperimen independen. Nilai P ditemtokake dening pirang-pirang t-tes (*** P <0,01). (C) Dibandhingake karo asites HGSC, sel T (non-sitotoksik) nuduhake peningkatan ekspresi TNF ing tumor. Werna-werna kasebut nggambarake pasien sing beda-beda. Sel-sel sing ditampilake wis dicuplik kanthi acak nganti 300 lan di-jitter kanggo mbatesi overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA sing diusulake kanggo kanker ovarium. MNA diprodhuksi ing sel tumor lan fibroblas ing TME lan dijupuk dening sel T. MNA nambah pengikatan Sp1 menyang promotor TNFα, sing nyebabake peningkatan transkripsi TNFα lan produksi sitokin TNFα. MNA uga nyebabake penurunan IFN-γ. Inhibisi fungsi sel T nyebabake penurunan kemampuan mateni lan nyepetake pertumbuhan tumor.
Miturut laporan, TNFα nduweni efek anti-tumor lan anti-tumor sing gumantung saka ngarep lan mburi, nanging nduweni peran sing kondhang kanggo ningkatake pertumbuhan lan metastasis kanker ovarium (31-33). Miturut laporan, konsentrasi TNFα ing asites lan jaringan tumor ing pasien kanker ovarium luwih dhuwur tinimbang ing jaringan jinak (34-36). Babagan mekanisme, TNFα bisa ngatur aktivasi, fungsi lan proliferasi sel getih putih, lan ngganti fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten karo temuan kasebut, analisis ekspresi gen diferensial nuduhake yen TNF diatur kanthi signifikan ing sel T ing jaringan tumor dibandhingake karo asites (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF mung katon ing populasi sel T kanthi fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Ringkesane, data kasebut ndhukung pandangan yen MNA nduweni efek imunosupresif ganda lan promosi tumor ing HGSC.
Pelabelan fluoresen adhedhasar sitometri aliran wis dadi metode utama kanggo nyinaoni metabolisme TIL. Panliten iki nuduhake yen dibandhingake karo limfosit getih perifer utawa sel T saka organ limfoid sekunder, TIL murine lan manungsa duwe kecenderungan sing luwih dhuwur kanggo nyerep glukosa (4, 39) lan ilang fungsi mitokondria kanthi bertahap (19, 40). Sanajan kita wis mirsani asil sing padha ing panliten iki, pangembangan utama yaiku mbandhingake metabolisme sel tumor lan TIL saka jaringan tumor sing direseksi sing padha. Konsisten karo sawetara laporan sadurunge, sel tumor (CD45-EpCAM +) saka asites lan tumor duwe penyerapan glukosa sing luwih dhuwur tinimbang sel T CD8 + lan CD4 +, sing ndhukung yen penyerapan glukosa sing dhuwur saka sel tumor bisa dibandhingake karo sel T. Konsep kompetisi sel T. TME. Nanging, aktivitas mitokondria sel tumor luwih dhuwur tinimbang sel T CD8 +, nanging aktivitas mitokondria padha karo sel T CD4 +. Asil kasebut nguatake tema sing muncul yen metabolisme oksidatif penting kanggo sel tumor (41, 42). Dheweke uga menehi saran yen sel CD8 + T bisa uga luwih rentan marang disfungsi oksidatif tinimbang sel CD4 + T, utawa sel CD4 + T bisa uga nggunakake sumber karbon liyane saka glukosa kanggo njaga aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu dicathet yen kita ora mirsani bedane ing serapan glukosa utawa aktivitas mitokondria antarane efektor CD4 + T, memori efektor T lan sel memori pusat T ing asites. Kajaba iku, kahanan diferensiasi sel CD8 + T ing tumor ora ana hubungane karo owah-owahan serapan glukosa, sing nyoroti bedane sing signifikan antarane sel T sing dikultur in vitro lan TIL manungsa in vivo (22). Pengamatan kasebut uga dikonfirmasi kanthi nggunakake alokasi populasi sel otomatis sing ora bias, sing luwih lanjut nuduhake yen sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + kanthi serapan glukosa lan aktivitas mitokondria sing luwih dhuwur tinimbang sel tumor umum nanging duwe populasi sel aktif Metabolik. Populasi iki bisa uga makili subpopulasi putatif sel penekan myeloid utawa sel dendritik plasmacytoid sing diidentifikasi ing analisis scRNA-seq. Senajan loro-lorone iki wis dilapurake ing tumor ovarium manungsa [45], isih butuh riset luwih lanjut kanggo njlentrehake subpopulasi myeloid iki.
Sanajan metode adhedhasar flow cytometry bisa njlentrehake bedane umum ing metabolisme glukosa lan oksidatif antarane jinis sel, metabolit sing tepat sing diasilake dening glukosa utawa sumber karbon liyane kanggo metabolisme mitokondria ing TME durung ditemtokake. Nemtokake anane utawa ora anane metabolit menyang subset TIL sing diwenehake mbutuhake pemurnian populasi sel saka jaringan sing dipotong. Mulane, metode pengayaan sel sing digabungake karo spektrometri massa bisa menehi wawasan babagan metabolit sing diperkaya kanthi beda ing sel T lan populasi sel tumor ing sampel pasien sing cocog. Sanajan metode iki duwe kaluwihan tinimbang penyortiran sel sing diaktifake fluoresensi, perpustakaan metabolit tartamtu bisa kena pengaruh amarga stabilitas sing ana lan/utawa tingkat pergantian sing cepet (22). Nanging, metode kita bisa ngenali rong metabolit imunosupresif sing diakoni, adenosin lan kynurenin, amarga beda-beda banget antarane jinis sampel.
Analisis metabonomi tumor lan subtipe TIL menehi wawasan luwih akeh babagan peran metabolit ing TME ovarium. Kapisan, nggunakake flow cytometry, kita nemtokake manawa ora ana bedane aktivitas mitokondria antarane tumor lan sel T CD4 +. Nanging, analisis LC-MS/MS nuduhake owah-owahan sing signifikan ing akehe metabolit ing antarane populasi kasebut, sing nuduhake manawa kesimpulan babagan metabolisme TIL lan aktivitas metabolisme sakabèhé mbutuhake interpretasi sing ati-ati. Kapindho, MNA minangka metabolit kanthi bedane paling gedhe antarane sel CD45 lan sel T ing asites, dudu tumor. Mulane, kompartementalisasi lan lokasi tumor bisa uga duwe efek sing beda ing metabolisme TIL, sing nyoroti kemungkinan heterogenitas ing lingkungan mikro tartamtu. Katelu, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT utamane diwatesi ing CAF, yaiku sel tumor kanthi tingkat sing luwih murah, nanging tingkat MNA sing bisa dideteksi diamati ing sel T sing asale saka tumor. Overekspresi NNMT ing CAF ovarium duwe efek promosi kanker sing dikenal, sebagian amarga promosi metabolisme CAF, invasi tumor lan metastasis (27). Senajan tingkat TIL sakabèhé moderat, ekspresi NNMT ing CAF raket banget karo subtipe mesenchymal Cancer Genome Atlas (TCGA), sing ana gandhèngané karo prognosis sing kurang apik (27, 46, 47). Pungkasan, ekspresi enzim AOX1 sing tanggung jawab kanggo degradasi MNA uga diwatesi ing populasi CAF, sing nuduhaké yèn sèl T ora nduwèni kemampuan kanggo metabolisme MNA. Asil iki ndhukung gagasan yèn sanajan butuh riset luwih lanjut kanggo verifikasi temuan iki, tingkat MNA sing dhuwur ing sèl T bisa nuduhaké anané lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Amarga tingkat ekspresi transporter MNA sing kurang lan tingkat protein kunci sing ora bisa dideteksi sing melu metabolisme MNA, anané MNA ing sel T ora dikarepke. NNMT utawa AOX1 ora bisa dideteksi kanthi analisis scRNA-seq lan qPCR sing ditargetake saka rong kohort independen. Asil kasebut nuduhake yen MNA ora disintesis dening sel T, nanging diserep saka TME ing sekitar. Eksperimen in vitro nuduhake yen sel T cenderung nglumpukake MNA eksogen.
Panliten in vitro kita nuduhake yen MNA eksogen ngindhuksi ekspresi TNFα ing sel T lan nambah pengikatan Sp1 menyang promotor TNFα. Sanajan TNFα nduweni fungsi anti-tumor lan anti-tumor, ing kanker ovarium, TNFα bisa ningkatake pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα ing kultur sel tumor ovarium utawa eliminasi sinyal TNFα ing model tikus bisa ningkatake produksi sitokin inflamasi sing dimediasi TNFα lan nyegah pertumbuhan tumor (32, 35). Mulane, ing kasus iki, MNA sing asale saka TME bisa tumindak minangka metabolit pro-inflamasi liwat mekanisme sing gumantung karo TNFα liwat loop autokrin, saengga ningkatake kedadeyan lan panyebaran kanker ovarium (31). Adhedhasar kemungkinan iki, blokade TNFα lagi ditliti minangka agen terapeutik potensial kanggo kanker ovarium (37, 48, 49). Kajaba iku, MNA ngrusak sitotoksisitas sel CAR-T menyang sel tumor ovarium, menehi bukti luwih lanjut kanggo penekanan kekebalan sing dimediasi MNA. Sacara kolektif, asil iki nuduhake model ing ngendi tumor lan sel CAF ngetokake MNA menyang TME ekstraseluler. Liwat (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium sing diinduksi TNF lan (ii) inhibisi aktivitas sitotoksik sel T sing diinduksi MNA, iki bisa uga duwe efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulane, kanthi ngetrapake kombinasi pengayaan sel kanthi cepet, sekuensing sel tunggal, lan profil metabolik, panliten iki nuduhake bedane imunometabolomik sing gedhe antarane tumor lan sel asites ing pasien HGSC. Analisis komprehensif iki nuduhake manawa ana bedane penyerapan glukosa lan aktivitas mitokondria antarane sel T, lan ngidentifikasi MNA minangka metabolit pengatur kekebalan otonom non-sel. Data kasebut nduweni pengaruh babagan kepiye TME mengaruhi metabolisme sel T ing kanker manungsa. Sanajan kompetisi langsung kanggo nutrisi antarane sel T lan sel kanker wis dilaporake, metabolit uga bisa tumindak minangka regulator ora langsung kanggo ningkatake perkembangan tumor lan bisa uga nyegah respon kekebalan endogen. Katrangan luwih lanjut babagan peran fungsional metabolit pengatur iki bisa mbukak strategi alternatif kanggo nambah respon kekebalan anti-tumor.
Spesimen lan data klinis pasien dijupuk liwat repositori jaringan tumor kanker BC sing disertifikasi dening Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Miturut protokol sing disetujoni dening Komite Etika Riset Kanker BC lan Universitas British Columbia (H07-00463), kabeh spesimen lan data klinis pasien entuk idin tertulis sing diinformasikake utawa kanthi resmi mbatalake idin kasebut. Sampel disimpen ing BioBank sing disertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien sing rinci dituduhake ing Tabel S1 lan S5. Kanggo kriopreservasi, pisau bedah digunakake kanggo ngurai sampel tumor pasien kanthi mekanik banjur didorong liwat filter 100 mikron kanggo entuk suspensi sel tunggal. Asites pasien disentrifugasi ing 1500 rpm sajrone 10 menit ing suhu 4°C kanggo ngebentuk pelet sel lan mbusak supernatan. Sel sing dijupuk saka tumor lan asites dikriopreservasi ing 50% serum AB manungsa sing ora aktif amarga panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) lan 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal sing diawetake iki dicairke lan digunakake kanggo metabolomik lan panentu metabolit sing diterangake ing ngisor iki.
Medium lengkap iki kasusun saka 0,22 μm sing disaring 50:50 sing ditambah RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) sing ditambah karo 10% serum AB manungsa sing ora aktif panas (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x larutan Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) lan 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambah karo 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) lan 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Buffer pewarnaan flow cytometer kasusun saka 0,22 μm saline buffer fosfat sing disaring (PBS; Invitrogen) sing ditambah karo 3% serum manungsa AB sing ora aktif panas (Sigma). Buffer pengayaan sel kasusun saka PBS sing disaring 0,22μm lan ditambah karo serum AB manungsa sing ora aktif kanthi panas 0,5% (Sigma-Aldrich).
Ing medium lengkap 37°C, sel diwernani nganggo 10 nM MT DR lan 100 μM 2-NBDG suwene 30 menit. Sabanjure, sel-sel kasebut diwernani nganggo pewarna viabilitas eF506 ing suhu 4°C suwene 15 menit. Suspensikake maneh sel-sel kasebut ing FC Block (eBioscience) lan Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), encerake ing buffer pewarnaan flow cytometer (miturut pandhuan pabrikan), lan inkubasi suwene 10 menit ing suhu kamar. Wernakake sel-sel kasebut nganggo sakumpulan antibodi (Tabel S2) ing buffer pewarnaan flow cytometry ing suhu 4°C suwene 20 menit. Suspensikake maneh sel-sel kasebut ing buffer pewarnaan flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sadurunge dianalisis. Gunakake SpectroFlo lan FlowJo V10 kanggo nganalisis data cacah sel, lan gunakake GraphPad Prism 8 kanggo nggawe data kasebut. Intensitas fluoresensi median (MFI) saka 2-NBDG lan MT DR dinormalisasi log, banjur uji t sing dipasangake digunakake kanggo analisis statistik kanggo ngetung pasien sing cocog. Copot kabeh populasi kanthi kurang saka 40 kedadeyan saka analisis; lebokake nilai MFI 1 kanggo nilai negatif sadurunge nindakake analisis statistik lan visualisasi data.
Kanggo nambahi strategi gating manual saka panel proses ing ndhuwur, kita nggunakake anotasi lengkap dening wit watesan bentuk (FAUST) (21) kanggo kanthi otomatis menehi sel menyang populasi sawise ngilangi sel mati ing FlowJo. Kita ngatur output kanthi manual kanggo nggabungake populasi sing katon salah alokasi (nggabungake PD1+ karo sel tumor PD1) lan populasi sing ditahan. Saben sampel ngemot rata-rata luwih saka 2% sel, kanthi total 11 populasi.
Sentrifugasi kerapatan gradien Ficoll digunakake kanggo misahake PBMC saka produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies). Sel T CD8 + diisolasi saka PBMC nggunakake CD8 MicroBeads (Miltenyi) lan diekspansi ing medium lengkap nggunakake TransAct (Miltenyi) sajrone 2 minggu miturut pandhuan pabrikan. Sel-sel kasebut diidini ngadeg sajrone 5 dina ing medium lengkap sing ngemot IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), banjur distimulasi maneh nganggo TransAct. Ing dina kaping 7, miturut pandhuan pabrikan, CD45 MicroBeads manungsa (Miltenyi) digunakake kanggo ngayakake sel ing telung babak berturut-turut. Sel-sel kasebut dialikutasi kanggo analisis sitometri aliran (kaya sing diterangake ing ndhuwur), lan siji yuta sel dialikutasi kaping telu kanggo analisis LC-MS/MS. Sampel kasebut diproses dening LC-MS/MS kaya sing diterangake ing ngisor iki. Kita ngira-ngira nilai metabolit sing ilang kanthi nomer ion 1.000. Saben sampel dinormalisasi nganggo nomer ion total (TIC), diowahi sacara logaritmik, lan dinormalisasi kanthi otomatis ing MetaboAnalystR sadurunge dianalisis.
Suspensi sel tunggal saben pasien dicairke lan disaring liwat filter 40 μm menyang medium lengkap (kaya sing diterangake ing ndhuwur). Miturut protokol pabrikan, telung puteran seleksi positif berturut-turut kanthi pamisahan manik magnetik nggunakake MicroBeads (Miltenyi) digunakake kanggo ngayakake sampel kanggo sel CD8+, CD4+ lan CD45- (ing es). Cekakipun, sel-sel kasebut disuspensi maneh ing buffer pengayaan sel (kaya sing diterangake ing ndhuwur) lan diitung. Sel-sel kasebut diinkubasi karo manik-manik CD8 manungsa, manik-manik CD4 manungsa utawa manik-manik CD45 manungsa (Miltenyi) ing suhu 4°C sajrone 15 menit, banjur dicuci nganggo buffer pengayaan sel. Sampel kasebut dilewati liwat kolom LS (Miltenyi), lan fraksi positif lan negatif dikumpulake. Kanggo nyuda durasi lan ngoptimalake langkah pemulihan sel, fraksi CD8 banjur digunakake kanggo puteran kapindho pengayaan CD4+, lan fraksi CD4 digunakake kanggo pengayaan CD45 sabanjure. Simpen larutan ing es sajrone proses pamisahan.
Kanggo nyiapake sampel kanggo analisis metabolit, sel-sel kasebut dikumbah sapisan nganggo larutan uyah sing adhem banget, lan 1 ml metanol 80% ditambahake ing saben sampel, banjur divorteks lan dibekukan ing nitrogen cair. Sampel kasebut dilewati telung siklus beku-cair lan disentrifugasi kanthi kecepatan 14.000 rpm sajrone 15 menit ing suhu 4°C. Supernatan sing ngemot metabolit kasebut diuapke nganti garing. Metabolit kasebut dilarutake maneh ing 50 μl asam format 0,03%, divorteks kanggo dicampur, banjur disentrifugasi kanggo mbusak lebu.
Ekstrak metabolit kaya sing diterangake ing ndhuwur. Pindahake supernatan menyang botol kromatografi cair kinerja dhuwur kanggo riset metabolomik. Gunakake protokol perawatan acak kanggo nambani saben sampel kanthi jumlah sel sing padha kanggo nyegah efek batch. Kita nindakake penilaian kualitatif metabolit global sing sadurunge diterbitake ing AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analisis kromatografi lan integrasi area puncak ditindakake nggunakake piranti lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Cacah ion 1000 digunakake kanggo ngira-ira nilai metabolit sing ilang, lan TIC saben sampel digunakake kanggo ngetung area puncak normalisasi saben metabolit sing dideteksi kanggo mbenerake owah-owahan sing disebabake dening analisis instrumental saka pangolahan sampel. Sawise TIC dinormalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter standar) digunakake kanggo konversi logaritmik lan skala garis norma otomatis. Kita nggunakake PCA karo paket vegan R kanggo nindakake analisis eksplorasi beda metabolit antarane jinis sampel, lan nggunakake analisis redundansi parsial kanggo nganalisis pasien. Gunakake metode Ward kanggo mbangun dendrogram peta panas kanggo nglumpukake jarak Euclidean antarane sampel. Kita nggunakake limma (52) babagan kelimpahan metabolit standar kanggo ngenali metabolit sing akeh banget ing kabeh jinis sel lan lingkungan mikro. Kanggo nyederhanakake panjelasan, kita nggunakake parameter rata-rata grup kanggo nemtokake model, lan nimbang jinis sel ing lingkungan mikro minangka saben grup (n = 6 grup); kanggo tes signifikansi, kita nindakake telung pangukuran bola-bali kanggo saben metabolit Kanggo nyegah replikasi palsu, pasien dilebokake minangka alangan ing desain limma. Kanggo mriksa bedane metabolit antarane pasien sing beda-beda, kita nyetel model limma sing kalebu pasien kanthi cara sing tetep. Kita nglaporake pentinge kontras sing wis ditemtokake sadurunge antarane jinis sel lan lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Sawise pengayaan vigor nggunakake Miltenyi Dead Cell Removal Kit (viabilitas >80%), sekuensing transkriptom sel tunggal ditindakake ing total asites beku urip lan sampel tumor nggunakake protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kasus kanthi tumor lan asites sing cocog dianalisis, sanajan viabilitas sing kurang saka siji sampel tumor nyegah inklusi kasebut. Kanggo entuk macem-macem pilihan pasien, kita nggabungake sampel saben pasien ing jalur pengontrol kromium 10x, lan nganalisa asites lan situs tumor kanthi kapisah. Sawise sekuensing [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 lan 41.378 maca saben sel kanggo tumor lan asites]], kita nggunakake CellSNP lan Vireo (53) (adhedhasar CellSNP minangka SNP manungsa umum (VCF) sing diwenehake dening GRCh38 diwenehi identitas donor. Kita nggunakake SNPRelate kanggo nyimpulake identitas paling cedhak (IBS) saka status genotipe pasien (IBS), ora kalebu sel sing ora ditugasake lan sel sing diidentifikasi minangka dupleks lan donor sing cocog antarane asites lan sampel tumor (54). Adhedhasar tugas iki, kita nahan telung kasus kanthi perwakilan sel sing akeh ing tumor lan asites kanggo analisis hilir. Sawise nindakake langkah filtrasi massa ing kemasan BioConductor scater (55) lan scran (56), iki ngasilake 6975 sel (2792 lan 4183 sel saka tumor lan asites, masing-masing) kanggo analisis. Kita nggunakake kluster Louvain igraph (57) saka jaringan tetanggan paling cedhak (SNN) sing dienggo bareng adhedhasar jarak Jaccard menyang sel kluster kanthi ekspresi. Kluster-kluster kasebut dianotasi kanthi manual miturut jinis sel putatif adhedhasar ekspresi gen penanda lan divisualisasikake nganggo t-SNE. Sel T sitotoksik ditetepake dening ekspresi CD8A lan GZMA, ora kalebu subkluster kanthi ekspresi protein ribosom sing kurang. Kita ngakses data sing diterbitake saka Izar et al. (16), kalebu penyematan t-SNE, bisa ngontrol tumpang tindih ekspresi antarane penanda sel imun lan ekspresi NNMT.
PBMC dipisahake saka produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies) kanthi sentrifugasi kerapatan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi saka PBMC nggunakake manik-manik CD3 (Miltenyi). Kanthi anane utawa ora anane MNA, sel CD3 + diaktifake nganggo CD3 sing kaiket ing piring (5μg/ml), CD28 sing larut (3μg/ml) lan IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ing dina pungkasan ekspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) lan proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dievaluasi kanthi flow cytometry. Evaluasi fungsi efektor kanthi ngrangsang sel nganggo PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1μg/ml) nganggo GolgiStop sajrone 4 jam, lan monitor CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) lan TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Stimulasi sel qPCR lan ChIP nganggo PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1μg/ml) sajrone 4 jam. Supernatan ELISA dikumpulake sadurunge lan sawise stimulasi nganggo PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1 μg/ml) sajrone 4 jam.
Tindakake protokol pabrikan kanggo ngisolasi RNA nggunakake RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gunakake QIAshredder (QIAGEN) kanggo nghomogenake sampel. Gunakake kit RNA menyang cDNA kapasitas dhuwur (Thermo Fisher Scientific) kanggo nyintesis DNA komplementer (cDNA). Gunakake TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) kanggo ngukur ekspresi gen (miturut protokol pabrikan) nganggo probe ing ngisor iki: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehida-3-fosfat saka Hidrogen (GAPDH)] lan Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel-sampel kasebut dilakokake ing sistem PCR wektu nyata StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ing piring reaksi optik 96-sumur cepet MicroAmp (Applied Biosystems) nganggo film optik MicroAmp. Nilai Ct sing ngluwihi 35 dianggep ngluwihi ambang deteksi lan ditandhani minangka ora bisa dideteksi.
Lakokna ChIP kaya sing wis diterangake sadurunge (58). Cekakipun, sel-sel kasebut diolah nganggo formaldehida (konsentrasi pungkasan 1,42%) lan diinkubasi ing suhu ruangan suwene 10 menit. Gunakake buffer pembengkakan sing ditambah (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl lan 0,1% NP-40) ing es suwene 10 menit, banjur disuspensi maneh ing buffer imunopresipitasi kaya sing diterangake (58). Sampel banjur disonikasi nganggo siklus ing ngisor iki: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) lan wektu statis 40 detik. Inkubasi antibodi imunoglobulin G kelas ChIP (Teknologi Sinyal Sel; 1μl), histon H3 (Teknologi Sinyal Sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) lan SP1 (Teknologi Sinyal Sel; 3μl) kanthi sampel ing kocok 4°CC sewengi. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) karo sampel ing suhu 4°C kanthi diocok alon-alon sajrone 1 jam, banjur gunakake manik-manik chelex (Bio-Rad) kanggo ngayakake DNA, lan gunakake proteinase K (Thermo Fisher) kanggo pencernaan protein. Promotor TNFα dideteksi dening PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; kosok baline, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produk 207-bp). Gambar kasebut diprodhuksi dening Image Lab (Bio-Rad) lan diukur nggunakake piranti lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel dikumpulake kaya sing diterangake ing ndhuwur. Penentuan kasebut ditindakake miturut prosedur pabrikan kanggo kit TNFα ELISA manungsa (Invitrogen), kit IL-2 ELISA manungsa (Invitrogen) lan kit IFN-γ ELISA manungsa (Abcam). Miturut protokol pabrikan, supernatan diencerake 1:100 kanggo ndeteksi TNFα lan IL-2, lan 1:3 kanggo ndeteksi IFN-γ. Gunakake EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) kanggo ngukur absorbansi ing 450 nm.
PBMC dipisahake saka produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies) kanthi sentrifugasi kerapatan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi saka PBMC nggunakake manik-manik CD3 (Miltenyi). Kanthi anane utawa ora anane MNA, sel CD3 + diaktifake nganggo CD3 sing kaiket ing piring (5μg/ml), CD28 sing larut (3μg/ml) lan IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sajrone 3 dina. Sawise 3 dina, sel-sel kasebut dikumpulake lan dicuci nganggo larutan saline 0,9%, lan pelet kasebut dibekukan. Cacah sel ditindakake kanthi flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) nggunakake 123count eBeads.
Ekstrak metabolit kaya sing diterangake ing ndhuwur. Ekstrak garing dibentuk maneh kanthi konsentrasi 4000 ekivalen sel/μl. Analisis sampel kanthi kromatografi fase terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) lan kolom CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer massa polar (6470, Agilent), ing ngendi ionisasi elektrospray beroperasi ing mode positif. Fase gerak A yaiku 0,1% asam format (ing H2O), fase gerak B yaiku 90% asetonitril, 0,1% asam format. Gradien LC yaiku 0 nganti 2 menit kanggo 100% A, 2 nganti 7,1 menit kanggo 99% B, lan 7,1 nganti 8 menit kanggo 99% B. Banjur, imbangi maneh kolom karo fase gerak A kanthi laju aliran 0,6 ml/menit sajrone 3 menit. . Laju aliran yaiku 0,4ml/menit, lan ruang kolom dipanasake nganti 50°C. Gunakake standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) kanggo netepake wektu retensi (RT) lan transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92, Konversi 3 = 137→78). Nalika kabeh telung transisi kedadeyan ing wektu retensi sing bener, transisi 1 digunakake kanggo kuantifikasi kanggo njamin spesifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) digawe kanthi enem pengenceran serial larutan stok (1 mg/ml) kanggo entuk standar 0,1, 1,0, 10 lan 100 ng/ml lan 1,0 lan 10μg/ml cairan. Watesan deteksi yaiku 1 ng/ml, lan respon linier antara 10 ng/ml lan 10μg/ml. Saben injeksi rong mikroliter sampel lan standar digunakake kanggo analisis LC/MS, lan sampel kontrol kualitas campuran ditindakake saben wolung injeksi kanggo njamin stabilitas platform analisis. Respon MNA saka kabeh sampel sel sing diobati MNA ana ing kisaran linier uji coba. Analisis data ditindakake nggunakake piranti lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruk αFR-CAR generasi kapindho dijupuk saka Song et al. (59). Cekakipun, konstruk kasebut ngemot isi ing ngisor iki: urutan pamimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manungsa, wilayah engsel lan transmembran CD8a, domain intraseluler CD27 lan domain intraseluler CD3z. Urutan CAR lengkap disintesis dening GenScript, banjur diklon menyang vektor ekspresi lentiviral generasi kapindho ing sisih ndhuwur kaset ekspresi GFP sing digunakake kanggo ngevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus diprodhuksi kanthi transfeksi sel HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ditumbuhake ing medium Eagle sing dimodifikasi Dulbecco sing ngemot 10% serum sapi janin (FBS) lan 1% PenStrep, lan nggunakake vektor CAR-GFP lan plasmid kemasan (psPAX2 lan pMD2.G, Addgene) nggunakake lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatan sing ngemot virus dikumpulake 48 lan 72 jam sawise transfeksi, disaring, lan dikonsentrasikake kanthi ultrasentrifugasi. Simpen supernatan virus sing dikonsentrasi ing -80°C nganti transduksi.
PBMC dipisahake saka produk pamisahan leukosit donor sing sehat (STEMCELL Technologies) kanthi sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Gunakake manik-manik mikro CD8 seleksi positif (Miltenyi) kanggo ngisolasi sel CD8+ saka PBMC. Stimulasi sel T nganggo TransAct (Miltenyi) lan ing medium TexMACS [Miltenyi; ditambah karo serum manungsa sing ora aktif panas 3%, PenStrep 1% lan IL-2 (300 U/ml)]. Rong puluh papat jam sawise stimulasi, sel T ditransduksi nganggo lentivirus (10 μl supernatan virus pekat saben 106 sel). 1 nganti 3 dina sawise transduksi ing Cytek Aurora (ing FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel kanggo nduduhake efisiensi transduksi paling ora 30%.
Sel CAR-T dikultur sajrone 24 jam ing Immunocult (STEMCELL Technologies; ditambah karo 1% PenStrep) ing kahanan ing ngisor iki: ora diobati, diobati nganggo 250 μM adenosin utawa 10 mM MNA. Sawise perawatan awal, sel CAR-T dicuci nganggo PBS lan digabungake karo 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; ing medium McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ditambah karo 10% FBS lan 1% PenStrep ing 10: Rasio efektor karo target 1 diamplifikasi kanthi rangkap telu ing medium Immunocult sing ditambah. Sel SK-OV-3 lan sel SK-OV-3 sing dilisis nganggo saponin digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) digunakake minangka kontrol negatif lan positif. Sawisé 24 jam budidaya bebarengan, supernatan dikumpulaké lan laktat dehidrogenase (LDH) diukur miturut pandhuan pabrikan (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH diencerke 1:50 ing buffer LDH. Persentase pembunuhan diukur nggunakaké rumus ing ngisor iki: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimum x 100%, ing ngendi persentase koreksi = mung sel T kultur bebarengan, lan tingkat pembunuhan maksimum = kontrol positif-kontrol negatif.
Kaya sing diterangake ing teks utawa materi lan metode, gunakake GraphPad Prism 8, Microsoft Excel utawa R v3.6.0 kanggo analisis statistik. Yen pirang-pirang sampel dikumpulake saka pasien sing padha (kayata asites lan tumor), kita nggunakake uji t sing dipasangake utawa kalebu pasien minangka efek acak ing model linier utawa umum sing cocog. Kanggo analisis metabolomik, tes pentinge ditindakake kanthi rangkap telu.
Kanggo materi tambahan kanggo artikel iki, mangga deleng http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Iki minangka artikel akses terbuka sing disebarake miturut syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sing ngidini panggunaan, distribusi, lan reproduksi ing media apa wae, anggere panggunaan pungkasan ora kanggo keuntungan komersial lan premise yaiku karya asline bener. Referensi.
Cathetan: Kita mung njaluk sampeyan menehi alamat email supaya wong sing sampeyan rekomendasikake menyang kaca kasebut ngerti yen sampeyan pengin dheweke ndeleng email kasebut lan dudu spam. Kita ora bakal nangkep alamat email apa wae.
Pitakonan iki digunakake kanggo nguji apa sampeyan pengunjung lan nyegah kiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (Ralph J. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA nyumbang kanggo penekanan kekebalan sel T lan minangka target imunoterapi potensial kanggo perawatan kanker manungsa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (Ralph J. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA nyumbang kanggo penekanan kekebalan sel T lan minangka target imunoterapi potensial kanggo perawatan kanker manungsa.
© 2021 American Association for the Advancement of Science. kabeh hak dilindhungi undhang-undhang. AAAS minangka mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef lan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.